外源物質SNP，Spd對鹽堿脅迫下射幹幼苗傷害緩解作用的研究
資源與鑒定
作者：徐夢平 何平 段才緒 楊牟
重慶三峽庫區植物生態與資源重點實驗室， 重慶 400715）
[摘要] 為了鹽堿地開發利用及射幹的栽培管理提供理論依據，該實驗通過外施外源物質SNP，Spd來緩解NaCl，Na2SO4，NaHCO3，Na2CO3 4種鹽的摩爾比為9∶1∶9∶1，鹽濃度為100 mmol·L-1的混合鹽堿脅迫對射幹幼苗造成的傷害，實驗結果顯示高pH脅迫是造成鹽堿脅迫的主要因素，時間和各處理濃度之間有交互作用，鹽，堿脅迫之間有協同效應。在100 mmol·L-1的鹽堿脅迫下射幹幼苗葉片中質膜過氧化指標（MDA，O-·2）和代謝產物（可溶性蛋白，可溶性糖，有機酸）的含量均呈現不同程度的上升趨勢。經過不同濃度的SNP，Spd處理後，MDA和O-·2顯著降低，並且有效提高了代謝產物的含量，其中SNP（0.05 mmol·L-1）和Spd（0.5 mmol·L-1）緩解傷害效果最佳。研究結果說明SNP，Spd能有效緩減鹽堿脅迫對射幹幼苗的傷害，提高射幹幼苗的耐鹽堿能力，從而為鹽堿地的利用和射幹種植提供科學基礎。
[關鍵詞] 鹽堿脅迫；外源物質；射幹幼苗；傷害緩解；生理生化指標
[收稿日期] 2014-05-27
[基金項目] 國家自然科學基金項目（30070080）
[通信作者] *何平，教授，博士生導師，Tel：（023）68254122，E-mail
[作者簡介] 徐夢平，碩士研究生，Tel：18883342571，E-mail
射幹Belamcanda chinensis （L.） DC.為鳶尾科多年生草本植物，是目前市場上緊缺的名貴中藥材之一[1]。近年來發現射幹耐鹽堿，利用耐鹽堿的植物對土壤鹽堿化進行改良是在眾多的生物措施中最為生態科學的[2]。選擇耐鹽堿的植物，了解植物的耐鹽堿機製，以及怎樣提高植物的耐鹽堿性已成為當務之急，許多學者研究證明目前利用外源物質提高植物的抗逆性是一條非常有用的途徑。本實驗選用外源物質SNP，Spd對鹽堿脅迫下射幹幼苗進行恢複，以明確射幹對鹽堿脅迫緩解的適宜濃度，從而為鹽堿地的利用以及射幹開發與改良提供理論依據。
1 材料
供試的射幹種子由河北安國勝利藥材種子市場提供，經何平教授鑒定為B. chinensis的幹燥成熟種子。Spd為Sigma公司生產，外源一氧化氮供體硝普鈉（SNP）由韓國KAIST提供。
2 方法
每盆留長勢整齊且健壯的4株幼苗，待其長至三葉一心時。選擇經預實驗證明的較為合適的濃度即 NaCl，Na2SO4，NaHCO3，Na2CO3 4種鹽的摩爾比為9∶1∶9∶1，鹽濃度為100 mmol·L-1溶液脅迫處理射幹幼苗，並用SNP，Spd 2種外源恢複物質來做恢複實驗，每種物質共設計6個處理梯度，包括空白對照組CK1、混合鹽脅迫對照組CK2、不同濃度SNP處理組T1～T4，不同濃度Spd處理組T5～T8。每處理設置3個重複，每隔2 d向花盆內添加恢複液直到花盆裏麵的土淋透為止。分別在鹽堿脅迫後第10，20，30天取樣測定，測量O-·2，MDA，可溶性蛋白，可溶性糖時均稱取0.3 g鮮葉用於酶液提取，測量3種有機酸時準確稱取0.1 g幹樣進行HPLC的樣品製備。
葉片中丙二醛（MDA）含量測定方法參照Velikova等的硫代巴比妥酸（TBA）檢測法[3]；用羥胺氧化反應測定O-·2含量[4]；可溶性蛋白值采用張誌良的方法測定[5]；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[6]；高效液相色譜法測量幼葉及根中3種有機酸含量：島津高效液相色譜儀（LC-20），草酸、檸檬酸、丁二酸對照品購於國家標準物質中心（HPLC≥98%）。色譜條件：Phenomenex C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-NaH2PO4（3∶97），用磷酸
調pH至2.0；流速1.0 mL·min-1；每次進樣量15 μL，檢測波長210 nm；柱溫25 ℃，使用前用0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣。在該色譜條件下進行草酸、檸檬酸、丁二酸含量的測定。
數據采用SPSS 19.0 軟件進行重複度量和單因素方差分析。並用Duncan′s多重比較法檢驗每個生理指標（α=0.05）的差異顯著性。文中均采用 Excel 2003軟件根據SPSS分析結果製作。
3 結果與分析
3.1 外源物質SNP，Spd對鹽堿脅迫下射幹幼苗質膜過氧化物指標的影響
3.1.1 外源物質SNP，Spd對鹽堿脅迫下射幹幼苗葉片中超氧陰離子產生速率（O-·2）的影響 經過SNP處理後的射幹幼苗，球形檢驗結果顯示， P<；0.05，不滿足球形檢驗，進行自由度調整，主體內效應檢驗結果顯示，各個時間點上的數據有統計學上顯著差異（P<；0.001）；時間和各處理濃度之間有交互作用（P<；0.05），說明時間因素的作用隨著各處理濃度的不同而不同；主體間效應檢驗結果顯示，各處理濃度之間沒有顯著差異，即各處理濃度緩解鹽堿脅迫下射幹幼苗中超氧陰離子產生速率的作用不顯著。
經過Spd處理後的射幹幼苗，球形檢驗結果顯示，P>；0.05，滿足球形檢驗，主體內效應檢驗結果顯示，外源物質Spd處理後各個時間點上的數據有顯著差異（P<；0.001）。時間和Spd各處理濃度之間有交互作用（P≤0.001），說明時間因素的作用隨著各處理組合的不同而不同；主體間效應檢驗結果顯示，各處理濃度之間差異不顯著。
由分析結果，經過鹽堿脅迫後，超氧陰離子的產生速率與CK1相比呈現增加的趨勢，但是隨著時間的延長有下降的趨勢。經過SNP處理後超氧陰離子的產生速率不同程度降低，其中第10天的時間點上各處理差異不顯著，而在第20，30天時SNP各處理對超氧陰離子產生速率的影響差異顯著（P<；0.05）。其中當處理時間為30 d，處理濃度為0.5 mmol·L-1達到最低值44.272 μmol·g-1·min-1（FW）；經過外源物質Spd恢複處理後，也同樣降低了超氧陰離子的產生速率，在第10天時影響不顯著，但是在第20，30天的時候，Spd各處理對超氧陰離子產生速率的影響較顯著（P<；0.05），其中當處理時間為30 d，處理濃度為0.5 mmol·L-1達到最低值40.288 μmol·g-1·min-1，與CK2（54.916 μmol·g-1·min-1）相比差異顯著（P<；0.05）。
3.1.2 外源物質SNP，Spd對鹽堿脅迫下射幹幼苗葉片中丙二醛含量的影響 經過SNP處理後的射幹幼苗，球形檢驗結果顯示，P>；0.05，滿足球形檢驗，主體內效應檢驗結果顯示，各個時間點上的數據差異不顯著；時間和各處理濃度之間有交互作用（P<；0.05），說明時間因素的作用隨著各處理濃度的不同而不同；主體間效應檢驗結果顯示，各處理濃度之間沒有顯著差異，即各處理濃度緩解鹽堿脅迫下射幹幼苗中丙二醛的作用不顯著。
經過Spd處理後的射幹幼苗，球形檢驗結果顯示，P>；0.05，滿足球形檢驗，主體內效應檢驗結果顯示，外源物質Spd處理後各個時間點上的數據差異不顯著。時間和Spd各處理濃度之間有交互作用（P≤0.001），說明時間因素的作用隨著各處理組合的不同而不同；主體間效應檢驗結果顯示，各處理濃度之間差異不顯著。
由分析結果得出，鹽堿脅迫下射幹幼苗葉片中丙二醛含量與空白對照相比出現前期和中期增加，後期降低，並且隨著時間的延長出現先增加後降低的趨勢。經過外源物質SNP恢複處理後，丙二醛的含量基本呈降低的趨勢，在第20天時顯著降低（P<；0.05），但在第10，30天的時間差異不顯著，並且當處理時間為20 d，處理濃度為0.05 mmol·L-1時降到最低值25.172 μmol·g-1（FW）與對照CK2（30.223 μmol·g-1，FW）相比差異顯著（P<；0.05）；經過Spd處理後與CK2相比，射幹幼苗葉片中丙二醛的含量不同程度下降。其中在20，30 d時丙二醛含量顯著降低（P<；0.05），當處理時間為30 d，處理濃度為0.5 mmol·L-1降到最低值25.009 μmol·g-1。