五指那藤三萜類化學成分研究
化學
作者：盧旭然 劉爍 王滿元 龔慕辛 王智民 陳筱清
[摘要] 采用溶劑法、矽膠柱色譜、ODS柱色譜和HPLC等手段對五指那藤Stauntonia obovatifoliola subsp. intermedia莖中的化學成分進行分離純化，並通過NMR，MS等譜學方法進行結構鑒定。從五指那藤莖的60%乙醇提取物中的乙酸乙酯、正丁醇萃取部位中分離得到19個化合物，分別為羽扇豆醇（1）、白樺酮酸（2）、白樺脂酸（3）、3-表-白樺脂酸（4）、木通種酸（5）、24-O-乙酰木通種酸（6）、3-O-α-L-阿拉伯糖基-30-去甲常春藤皂苷元-28-O-α-L-鼠李糖基（1→4）-β-D-葡萄糖基（1→6）-O-β-D-葡萄糖基酯（7）、Stauntoside A（8）、刺楸皂苷A（9）、刺楸皂苷J（10）、Kizuta saponin K10（11）、3-O-α-L-鼠李糖基（1→2）-O-α-L-阿拉伯糖基常春藤皂苷元-28-β-D-木糖基（1→6）-O-β-D-葡萄糖基酯（12）、刺楸皂苷B（13）、3-O-α-L-鼠李糖基（1→2）-O-α-L-阿拉伯糖基-常春藤皂苷元-28-O-β-D-葡萄糖基（1→6）-O-β-D-葡萄糖基酯（14）、sieboldianoside A（15）、septemoside A（16）、刺楸皂苷K（17）、刺楸皂苷 Ⅰ（18）、3-O-α-L-阿拉伯糖基（1→2）-O-β-D-葡萄糖醛酸基-常春藤皂苷元（19）。其中4，6，10，12，14，16～19為首次從該屬植物中分得，且6為新的天然產物。
[關鍵詞] 五指那藤；化學成分；三萜
[收稿日期] 2014-06-24
[基金項目] 國家“重大新藥創製”科技重大專項（2009ZX09301-005）子課題（2009ZX09301-005-004）
[通信作者] *龔慕辛，教授，Tel：（010）83911632，E-mail；*王智民，研究員，E-mail
[作者簡介] 盧旭然，博士研究生，E-mail
五指那藤Stauntonia obovatifoliola Hayata subsp. intermedia為木通科Lardizabalaceae Hayata subsp. intermedia野木瓜屬Stauntonia木質藤本植物，主產於我國廣東、廣西、湖南省[1]。為廣西民間習用藥材，在瑤藥裏有“白九牛”之稱，主要治療風濕痛、腎炎水腫、尿血等證[2]。在壯藥裏，被稱作“那藤”，其莖、葉能祛風止痛，舒筋活絡，用於風濕骨痛，跌打損傷和水腫，果實用於疝氣[3]。關於五指那藤的研究報道並不多見，但其同屬植物野木瓜S. chinensis DC.研究較多。野木瓜屬植物的化學成分包含五環三萜及其苷類、去甲五環三萜及其苷類、木脂素類、黃酮類、酚類等，以三萜苷類成分為主[4]。本文對五指那藤60%乙醇提取物的乙酸乙酯、正丁醇可溶部分進行了化學成分研究。從該植物中分離純化得到19個三萜類化合物，其中9種化合物為首次從該屬植物中分離得到，且1種為新的天然產物。
1 材料
核磁用Bruker Avance II 500M核磁共振儀測定，以TMS為內標，質譜用Bruker microTOF和Bruker FT-ICR-MS solarix Maldi/ESI 9.4T質譜儀測定；柱色譜用矽膠（100～200目，200～300目）及薄層色譜用矽膠GF254和矽膠G均為青島海洋化工廠產品。D101大孔樹脂購自天津市海光化工有限公司。反相預製板（0.25 mm）購自Merk公司，HPLC為Shimadzu LC-20A，檢測器為PDA。半製備柱為Agilent Eclipse XDB-C18（9.4 mm×250 mm，5 μm）。
五指那藤藥材於2011年10月采自廣西省隆安縣，由廣西壯族自治區藥用植物研究所戴斌研究員鑒定為S.obovatifoliola Hayata subsp. intermedia的藤莖，樣品保存在本實驗室，編號為WZNT20111030。
2 提取與分離
取五指那藤14.8 kg，粉碎後加6倍量60%乙醇浸泡2 h。回流提取2次，每次4 h，濾液減壓濃縮（60 ℃以下）回收乙醇至無醇味（約10 L）。依次用5倍量乙酸乙酯、正丁醇（水飽和）萃取5次，濃縮至浸膏，所得乙酸乙酯可溶部分275 g，正丁醇可溶部分600 g。
正丁醇可溶部位加水溶解，取上清液過D101大孔樹脂柱，柱體積約為8 L，分別用30%，50%，70%乙醇和95%乙醇（各4倍柱體積）洗脫，所得30%乙醇部位52.8 g，50%乙醇部位371.3 g，70%乙醇部位104.9 g，95%乙醇部位16.6 g。
2.1 乙酸乙酯部位的分離 乙酸乙酯部位浸膏經矽膠柱分離，采用正己烷-乙酸乙酯 （100∶1～100∶2～100∶3～100∶5～100∶8～10∶1～8∶1～6∶1～4∶1），二氯甲烷-丙酮（20∶1～10∶1～8∶1～6∶1～4∶1～2∶1），二氯甲烷-甲醇（20∶1～10∶1～4∶1～0∶1）3種溶劑係統不同梯度依次洗脫，共得到120個流分。Fr. 21～22，Fr. 28～29，Fr. 34～37，經重結晶後分別得到化合物1（約60 mg）和2（約40 mg）。Fr. 11～12經矽膠柱以石油醚-乙酸乙酯（20∶1～10∶1）比例洗脫，得化合物6（約10 mg）。Fr. 41～42經矽膠柱以環己烷-乙酸乙酯（20∶1～10∶1）比例洗脫，得化合物3（約280 mg）。Fr. 70～72經矽膠柱以石油醚-丙酮（5∶1～5∶2～5∶3）比例洗脫，得化合物5（約60 mg）。Fr.90重結晶得到化合物4（約30 mg）；Fr.115重結晶得化合物9（約650 mg）。
2.2 正丁醇部位D101大孔樹脂柱50%乙醇洗脫部位的分離 取50%乙醇洗脫部位浸膏268g，經矽膠柱以氯仿-甲醇-水（3∶1∶0.075～2∶1∶0.075～1∶1∶0.075～0∶1∶0）洗脫，共得到72個流分。Fr. 22上反相矽膠柱（ODS），用30%，50%甲醇洗脫，得化合物11（約90 mg），12（20 mg）；用27%乙腈-水經HPLC半製備柱色譜分離得化合物7（約10 mg），8（約26 mg）。Fr.29用28%乙腈-水經HPLC半製備柱分離得化合物13（約100 mg），14（約52 mg）；Fr.35用26.5%乙腈-水經HPLC半製備柱色譜分離得化合物15（約600 mg）；Fr.49經HPLC半製備柱色譜以24.5%乙腈-水洗脫分離得化合物16（約52 mg）；Fr.53經HPLC半製備柱以23%乙腈-水洗脫分離得化合物17（約91 mg）及18（約520 mg）。
2.3 正丁醇部位D101大孔樹脂柱70%乙醇洗脫部位的分離 取70%乙醇洗脫部位浸膏87 g，經矽膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇-水（5∶1∶0.075～3∶1∶0.075～2∶1∶0.075～0∶1∶0）梯度洗脫，共得到56個流分。Fr.7加丙酮產生白色沉澱，重結晶得化合物9（259 mg）；Fr.30～32同法得到化合物10（400 mg）；Fr.40經HPLC半製備柱色譜以24.5%乙腈-水洗脫分離得化合物19（約30 mg）。
3 結構鑒定
化合物1 白色結晶（乙酸乙酯），Liebermann-Burchard反應陽性，Molish反應陰性。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：4.69（1H，br s，Ha-29），4.57（1H，br s，Hb-29），3.19（1H，dd，J=11.5，4.5 Hz，H-3），2.38（1H，m，H-19），0.76，0.79，0.83，0.95，0.97，1.03，1.68 （each 3H，s，H-24，28，25，27，23，26，30）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）。以上數據與文獻[5]報道的羽扇豆醇一致，鑒定化合物1為羽扇豆醇（lupeol）。
化合物2 白色針晶（氯仿），Liebermann-Burchard反應陽性，Molish反應陰性。EI-MS m/z 453.4[M-H]-。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：0.93 （3H，s，H-23），0.98 （3H，s，H-24），0.99（3H，s，H-25），1.02（3H，s，H-26），1.07（3H，s，H-27），1.70（3H，s，H-30），4.75（1H，br s，Ha-29），4.62（1H，br s，Hb-29）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）。上述數據與文獻[6]中白樺酮酸的數據一致，故鑒定化合物2為白樺酮酸（betulinonic acid）。
化合物3 白色針晶（氯仿），Liebermann-Burchard反應陽性，Molish反應陰性。EI-MS m/z 455.4[M-H]-。1H-NMR（DMSO，500 MHz）δ：0.65（3H，s，H-23），0.76（3H，s，H-25），0.87（3H，s，H-24），0.87（3H，s，H-26），0.93（3H，s，H-27），1.64（3H，s，H-30），3.00（1H，m，H-19），3.39（1H，br s，H-3），4.69（1H，br s，Ha-29），4.56（1H，br s，Hb-29）。13C-NMR（DMSO，125 MHz）。上述數據與文獻[7]中白樺脂酸的數據一致，故鑒定化合物3為白樺脂酸（betulinic acid）。
化合物4 白色針晶（氯仿），Liebermann-Burchard反應陽性，Molish反應陰性。EI-MS m/z 455.4[M-H]-。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：0.82（3H，s，H-23），0.84（3H，s，H-25），0.93（3H，s，H-24），0.94（3H，s，H-26），0.99（3H，s，H-27），1.69（3H，s，H-30），3.01（1H，m，H-19），3.40（1H，br t，J=2.5 Hz，H-3），4.74（1H，br s，Ha-29），4.61（1H，br s，Hb-29）。13C-NMR（CDCl3，125 MHz）。其中，C-1～C-5與白樺脂酸相比，均向高場移動Δδ1～6，其餘完全一致，說明C3上的-OH由β取代變為α取代。上述數據與文獻[8]中3-表-白樺脂酸的數據一致，故鑒定化合物4為3-表-白樺脂酸（3-epi-betulinic acid）。
化合物5 白色針晶（氯仿），Liebermann-Burchard反應陽性，Molish反應陰性。EI-MS m/z455.3[M-H]-。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）中4個甲基單峰質子信號δ： 0.98，1.03，1.17，1.64；2個亞甲基質子信號δ 4.75（1H，s），4.79（1H，s）；2個羥甲基質子信號δ：3.84（1H，d，J=10.8 Hz），4.09（1H，d，J=10.8 Hz）；1個羥基質子信號δ 4.45（1H，br s）。此外，還有δ 3.24（1H，dd，J=4.8，13.6 Hz），5.52（1H，br t，J=3.0 Hz），分別為C-18氫質子信號和C-12的烯質子信號。13C-NMR（CDCl3，125 MHz），其中顯示C-3在70.1，比3β-OH向高場位移，所以推斷為3α-OH。上述數據與文獻[9]中quinatic acid（木通種酸）的數據一致，故鑒定化合物5為木通種酸。
化合物6 白色針晶（氯仿），Liebermann-Burchard反應陽性，Molish反應陰性。HR-ESI-MS m/z 497.325 90[M-H]-。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）中5個甲基單峰質子信號δ 0.87，0.90，1.15，1.22，1.98（each 3H，s）；2個羥甲基質子信號δ4.03（1H，d，J=11.2 Hz），4.26（1H，d，J=11.2 Hz）；2個亞甲基質子信號δ4.65（1H，s），4.68（1H，s）和1個烯質子信號5.43（1H，br t，J=3.3 Hz）。13C-NMR數據與化合物5的數據相比，多了1個羰基信號170.8和甲基信號20.8，其餘大部分一致，根據位移變化，推測化合物6為24-O-乙酰木通種酸。上述數據與文獻[9]中quinatic acid與乙酸酐反應所得1c（24-O-乙酰木通種酸）的數據一致。故鑒定化合物6為24-O-乙酰木通種酸（24-O-acetyl quinatic acid）。該化合物為新的天然產物，結合HMQC二維核磁數據，對該化合物的數據13C，1H數據進行歸屬。
化合物7 白色粉末，Liebermann-Burchard反應陽性，Molish反應陽性。HR- ESI-MS m/z 1 059.532 28[M+H]+，分子式為C52H82O22（計算值為1 058.539 77）。1H-NMR（C5D5N，500 MHz）δ：0.95（3H，s），0.99（3H，s），1.11（3H，s），1.16（3H，s），1.71（3H，d，J=6.2 Hz，Rha H-6），4.98（1H，d，J=7.0 Hz，Ara H-1），6.20（1H，d，J=8.0 Hz，Glc H-1），4.97（1H，d，J=7.9 Hz，Glc′ H-1），5.85（1H，br s，Rha H-1），5.45（1H，br s，H-12），4.69（1H，br s，H-29a），4.75（1H，br s，H-29b）。13C-NMR（C5D5N，125 MHz）。上述數據與文獻[10]中3-O-α-L-arabinopyranosyl-30-nor-hederagenin-28-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1→4）-β-D-glucopyranosyl-（1→6）-β-D-glucopyranosyl ester（3-O-α-L-阿拉伯糖基-30-去甲常春藤皂苷元-28-O-α-L-鼠李糖基（1→4）-β-D-葡萄糖基（1→6）-O-β-D-葡萄糖基酯）一致。