萬曆二十八年（1600年）初，朝廷派遣總督李化龍集結四川、貴州、湖廣各路地方軍合力剿匪，馬千乘與秦良玉率領三千白杆兵也征召之列。雖然播州山高水險，白杆兵卻如神兵出沒，經常給予叛軍出其不意的打擊，出奇製勝，這自然都得益於長期嚴格的山地訓練及特殊裝備。叛軍亦聞風喪膽。
雖說政府軍攻勢強大，叛軍仍負隅頑抗，調集所有兵力死守播州城，分別在鄧坎、桑木、烏江、河渡和婁山關設下五道關卡，每道關卡上均布置精兵防守。作為主力先鋒，秦良玉帶領五百白杆兵攻打鄧坎。鄧坎守將楊朝棟根本不將區區五百兵力放在眼裏，五千精兵全部列陣準備一舉殲滅秦良玉一部。麵對十倍於己的敵軍，秦良玉毫不畏懼，身跨一匹桃花馬，手握一杆長矛，威風凜凜地殺入敵陣。敵兵迅速如潮水般湧來將其團團圍住，秦良玉絲毫不亂方寸，左挑右砍，東突西衝，長矛飛舞之處，敵兵紛紛殞命。待漸漸靠近主將楊朝棟之際，她忽然飛身騰躍，眾人尚未反應過來，楊朝棟已被揪至馬上牢牢鉗製。主將被擒，敵軍立時陣腳大亂，白杆兵乘勝追殺，半晌工夫，五千敵兵死傷無數，潰不成軍。
攻下鄧坎後，剿匪大軍乘勝追擊，又順利地拿下了桑木、烏江、河渡三關，直達播州外圍的婁山關。婁山關是楊應龍老巢海龍囤的門戶，山勢高峻險要，道路狹窄，與海龍囤並稱天險，堪稱播州城的天然屏障，易守難攻，僅憑一條小路通行，大批兵馬隻能望而興歎，實屬“一夫當關，萬夫莫開”之地。白杆兵再次接令攻打婁山關。詳細研討之後，秦良玉與夫君馬千乘決定不予強攻，轉而巧取。這天淩晨，秦良玉與丈夫雙騎並馳，前往關口正麵誘敵，兩杆長矛上下翻飛，擋關的敵兵應聲而倒。後麵援兵趕緊前來救援，敵兵越聚越多將秦良玉夫婦層層圍住。此時數千白杆軍突然從天而降，由關口兩側包圍過來，敵兵防不勝防，損失慘重。原來，趁秦良玉夫婦誘敵之際，白杆兵將士從關卡兩側的懸崖處，憑著白杆長矛首尾相聯，攀越上關，出其不意地擊殺敵軍。攻下婁山關後，剿匪大軍一鼓作氣，攻克了叛軍據點播州城，楊應龍與愛妾周氏、何氏關門自縊，兒子楊朝棟、弟楊兆龍被俘。
萬曆二十八年（1600年）十二月，李化龍班師回朝，並將楊朝棟等69人押解到京師，磔於鬧市。至此，平播一戰以明廷完勝告終。論功行賞時，石柱白杆兵戰功卓著，秦良玉隨夫出征便展露鋒芒立下汗馬功勞，“連破金築七塞，取桑木關，為南川路戰功第一”，其巾幗不讓須眉的英勇行為得到了大明總督李化龍的嘉獎，他命人打造了一麵鐫刻著“女中丈夫”的銀牌贈予時年二十六歲的秦良玉，立時“女將軍”的英名遠播四方。
播州之役雖然耗費了湖廣、四川、貴州三省財力，但是，正如當時的官員朱國楨所說，如果不平定播州，四川周邊的少數民族就要紛紛效仿楊應龍，非但四川不保，雲南、貴州也可能不保。後來，瞿九思編《萬曆武功錄》，稱平定楊應龍是“唐宋以來一大偉績”。
鴛鴦袖裏握兵符
萬曆四十一年（1613年），馬千乘死於獄中。《明史》記載，石柱部民狀告馬千乘，朝廷將其逮捕入雲陽獄，不久病死獄中。其實真正的死因是，萬曆派遣太監丘乘雲前往石柱監督開采銀礦，這些下派的監稅太監大權在手，胡作非為，以開礦為名義，到處敲詐勒索。馬千乘因開礦之事得罪丘乘雲，丘公公索賄不成懷恨在心，指使手下捏造罪名，將馬千乘投入雲陽獄中，馬千乘終不堪折磨病重而死，年僅 41歲。
馬千乘冤死，昔日溫馨和睦的家庭而今僅剩孤兒寡母，石柱百姓群情激奮，紛紛要求向大明朝廷討個說法，懲戒丘乘雲。秦良玉深明大義，毫無反叛之心，含淚隱忍埋葬了丈夫，甚至再三勸解眾人，曉以大義。按土司父死子襲，子幼則妻襲之製，因此時馬家的繼承人馬祥麟年紀還小，朝廷鑒於秦良玉作戰有功，文武兼長，遂令襲職，任石柱宣撫使。秦良玉得掌兵柄，從此卸裙釵，易冠帶，侍女衛隊皆戎裝雄服。在那個男子擁有絕對話語權的時代，一個女子要在一群男子中發號施令實屬不易，但她卻以柔弱的雙肩擔起了丈夫遺留的千金重擔，不但力保石柱一方平安，更在之後的南征北討中，聲威大震。《明史》中這樣稱讚秦良玉：“為人饒膽智，善騎射，兼通詞翰，儀度嫻雅。而馭下嚴峻，每行軍發令，戎伍肅然。”