大洋縱列海鞘中的嘌呤和哢啉生物堿成分研究
化學
作者：趙樹明 陸亞男 田曉清 楊橋 於慧娟 樊成奇
[摘要]從大洋縱列海鞘Symplegma oceania的甲醇提取部位中分離鑒定了5個嘌呤和哢啉生物堿成分，采用包括HPLC在內的多種色譜方法進行分離純化，應用多種波譜學方法，主要是MS，1H，NMR和13C，NMR，結合文獻對照確定上述化合物的結構為6，甲氧基，7，甲基，8，氧鳥嘌呤（ 1），2，甲基亞氨基，3，甲基，6，甲基氨基，9，氫，嘌呤（ 2），1，2，3，4，四氫，β，哢啉（ 3），1，甲基四氫，β，哢啉（ 4）和1，2，3，4，四氫，β，哢啉，3，羧酸（ 5），其中化合物 2～5均為首次從Symplegma屬海鞘中獲得，嘌呤、哢啉類是該種海鞘中生物堿成分的主要類型。
[關鍵詞]海鞘科；大洋縱列海鞘；嘌呤；哢啉
海鞘（ascidian）為脊索動物門 Chordata尾索亞門 Urochordata海鞘綱 Ascidiacea動物，營固著生活，在我國各海區均是主要附著的海洋汙損生物[1，2]。近年來，從海鞘中發現了諸多結構新穎、活性顯著的次生代謝產物，使其成為天然產物化學和藥物化學的研究熱點[3，5]。因此，雖然迄今為止中國產海鞘還沒有民間用藥的記載，但也是值得深入研究的一類動物，有望通過其藥用價值的基礎研究和後續的開發利用，成為與海馬、海龍、牡蠣、珊瑚等海洋動物一樣重要的藥用材料。
海鞘次生代謝產物結構多樣性十分豐富，但關於縱列海鞘屬品種研究比較少見。大洋縱列海鞘Symplegma oceania為海鞘綱瘤海鞘科Styelidae動物，屬複海鞘類，廣泛分布於我國羅源灣、廈門港、東山島、南澳島、大亞灣、香港、湛江和西沙永興島等水域[6]。文獻僅報道過從大洋縱列海鞘的同屬品種S. rubra 中分離鑒定的1個新嘌呤堿6，methoxy，7，methyl，8，oxoguanine和2個已知嘌呤堿類化合物，這也是該屬海鞘唯一的化學成分研究報道[7]；國內學者對大洋縱列海鞘醇提取物進行了抗乙肝病毒活性初步篩選，發現在較高劑量（>0.5 g·L-1）時，對HBsAg，HBeAg均有一定的抑製作用[8]；大洋縱列海鞘油脂中還富含具有降血脂功能的ω，3多不飽和脂肪酸[9]，而迄今未見該海鞘有關小分子化學成分研究的報道。為發現活性化學成分，筆者首次對大洋縱列海鞘進行了較為係統的化學成分提取分離，並從其提取物甲醇部位首次分離鑒定了2個嘌呤堿和3個哢啉生物堿共5個主要的化合物。
1 材料
Shimadzu SPD，M20A PDA檢測器；Bruker AM，400核磁共振波譜儀（TMS內標）；Finnigan LCQ DECA 質譜儀；半製備HPLC係統（Shimadazu LC，20AT 泵，SIL，20A 自動進樣器，SPD，M20A PDA 檢測器）以及YMC，Pack ODS，AQ 色譜柱（10 mm×250 mm，5 μm）。
MCI gel（CHP 20P，75～150 μm， Mitsubishi Chemical Ltd）；C18反相矽膠（150～200目，Merck公司）；凝膠Sephadex LH，20（Pharmacia Biotech，Sweden）；柱色譜矽膠（200～300 目） 及預製GF254 TLC矽膠板（青島海洋化學公司）；乙腈（色譜級，Tedia，USA）；其餘溶劑均為分析純（上海國藥集團化學試劑公司）。
新鮮海鞘於2008年6月采自南海大亞灣東山漁村海域，采集後以大量海水衝洗，-18 ℃快速冰凍，低溫條件下運回實驗室備用。品種由國家海洋局第三海洋研究所鄭成興研究員鑒定，為大洋縱列海鞘S. oceania。標本保存於中國水產科學研究院東海水產研究所（FDZ，，DS）。
2 提取與分離
大洋縱列海鞘濕重1.3 kg，剪切成碎片，用甲醇浸提5次，每次3 L；合並甲醇提取液，45 ℃水浴下真空濃縮回收甲醇溶劑，得到含大量海鹽的總浸膏。將總浸膏以1.2 L 60%甲醇溶解得到懸濁液，石油醚（60～90 ℃，250 mL×4）萃取，合並濃縮石油醚相得到低極性的油脂部分FDZ，PE（9.7 g）；甲醇，水相減壓濃縮除去甲醇至小體積，再以水稀釋至600 mL，用氯仿萃取4次，每次300 mL，氯仿相濃縮得FDZ，CL（6.0 g）；將剩餘水相減壓濃縮至小體積備用，得到褐色液體FDZ，Me。
將甲醇部位FDZ，Me進行MCI柱色譜分離，先用水1 000 mL洗脫除去無機鹽、多糖和蛋白質類物質，然後依次以甲醇，水（20：80～100：0，共5 L）梯度洗脫，按照TLC檢測分段濃縮，得到Me，I～V。向Me，I中加正丁醇萃取2次，回收有機相，合並入Me，II濃縮得1.1 g，然後經葡聚糖凝膠Sephadex LH，20色譜柱，70%乙醇洗脫，TLC檢測，得到Me，IIa和IIb。Me，IIa經半製備HPLC（乙腈，0.1%三氟乙酸溶液，20%～50%，流速2.5 mL·min-1）反複製備，在14.53，17.45 min得到化合物 4，5。Me，III（0.7 g）經RP，C18色譜分離（乙腈，水，20：80～35：65，共1 800 mL），得到Me，IIIa，Me，IIIb；Me，IIIb經HPLC反複製備，乙腈，0.1%三氟乙酸水溶液梯度洗脫，在18.60 min出峰，純化，得到化合物 3。Me，IV（1.7 g）上正相矽膠柱，氯仿，甲醇梯度洗脫（30：1～20：1～15：1～12：1～8：1，各500 mL），得到Me，IVa～IVe；Me，IVb，IVc分別經半製備HPLC純化，乙腈，0.1%三氟乙酸水溶液梯度洗脫，在11.25，15.08 min得到化合物 2，1。FDZ，CL通過進一步分離，TLC薄層檢測，發現主要成分為甾體和脂肪酸。