阿膠酶解物抗氧化肽的分離與質譜分析
化學
作者：李笑塵 閆利華 王智民 張啟偉 高建萍 陳兩綿 王錦玉 仝燕 張貴鋒
[摘要]采用陰離子交換纖維及Sephadex G，25柱色譜法對阿膠酶解物進行分離純化，以DPPH，ABTS法對阿膠酶解物及其不同部位進行體外抗氧化能力測定，從阿膠酶解物中篩選出體外抗氧化活性最強的部位，命名為GFC，1。GFC，1質量濃度為2.0 g·L-1時對DPPH清除率為47.95%， 0.40 g·L-1時對ABTS清除率為97.20%；利用LC，ESI，MS/MS結合TurboSEQUEST檢索軟件及Swiss，Prot數據庫從GFC，1中鑒定出9個小分子肽，並從中識別出高重複核心序列GPAGPP*GPP*（P*為羥脯氨酸）。
[關鍵詞]阿膠；抗氧化肽；LC，ESI，MS/MS；氨基酸序列
阿膠（Asini Corii Colla）為馬科動物驢Equusasinus L.的幹燥皮或鮮皮經煎煮、濃縮製成的固體膠[1]。阿膠始載於《神農本草經》，列為上品，《本草綱目》記載阿膠“和血滋陰、除風潤燥、化痰清肺、利小便、調大腸，聖藥也”[2]。現代藥理研究表明阿膠具有補血止血、抑瘤增效、提高免疫力、抗疲勞和耐缺氧等作用[3]，此外，其美容養顏的功效亦廣受認可。
近年來的研究認為疲勞、疾病及衰老產生的一大原因，是由於人體內各種外源性及內源性自由基在一定環境下與脂肪酸、蛋白質等物質作用，奪取氫原子，造成相關細胞的結構與功能被破壞[4]，因此抗氧化物質在對抗人體衰老、疾病中占據重要地位。已有研究證明以食源性蛋白作為原料，酶解成為低分子量的肽類成分具有抗氧化活性，被公認為更加安全、易吸收，在不同環境下具有較高的穩定性以及低致敏性[5]，其抗氧化作用原理，於多項研究中體現在對脂質過氧化的抑製[6]，清除自由基[7]和金屬離子螯合作用[8]等方麵，並有研究認為抗氧化活性強弱與其氨基酸組成、肽鏈結構及疏水性有較大關聯[9]。
阿膠主要成分為蛋白質（約80%）[10]，需經消化液酶解為低聚肽或氨基酸而被機體吸收，發揮藥效。現代研究表明相對分子質量過大很難為機體吸收或生物利用度極低[6]。本研究以阿膠飲片阿膠珠（蛤粉炒製）為原料，采用生物仿生酶解法獲得阿膠酶解物；同時，基於阿膠具有抗疲勞、提高免疫力、補血、美容等功效，本研究選擇多種抗氧化模型，分離純化抗氧化活性低聚肽並鑒定其結構，以期明確阿膠有效成分，並為阿膠的特征性鑒別和天然抗氧化肽的篩選提供依據。
1 材料
上海青浦滬西HD，3電腦紫外檢測儀；德國Christ冷凍幹燥機；美國Agilent，1200高效液相色譜儀；美國Thermo Fisher公司的LCQ DecaXP液相色譜，質譜聯用係統，數據采集與處理軟件為Xcalibur 1.3，蛋白質分析軟件為Bioworks 3.1（含TurboSEQUEST檢索軟件）。
阿膠（山東東阿阿膠股份有限公司，批號）；阿膠酶解產物（實驗室自製）；DE，52離子交換纖維素，Sephadex G，25填料（GE Healthcare）；DPPH（1，1，二苯基，2，苦基肼，北京中生瑞泰科技有限公司）；ABTS[2，2′，聯氮雙（3，乙基，苯並噻唑啉，6，磺酸）二銨鹽，東京化成工業株式會社]；抗壞血酸（Vit C，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（美國Fisher公司）；三氟乙酸（色譜純，阿法埃莎化學試劑公司）；其他試劑均為分析純。
2 方法
2.1 阿膠氨基酸組成分析 取1 g阿膠粉末，加入5 mL 0.05 mol·L-1的NaHCO3溶液，待樣品充分溶解後，離心5 min （1萬 r·min-1），收集中間澄明溶液，跟據文獻[11]中的方法對其進行水解及氨基酸組成分析。
2.2 阿膠酶解物及不同部位的生物活性分析
2.2.1 DPPH自由基清除實驗 根據文獻[12]中的DPPH實驗方法測定。
2.2.2 ABTS自由基清除實驗 根據文獻[13]中的ABTS實驗方法測定。
2.2.3 羥基自由基清除實驗 根據文獻[14]中的實驗方法測定。
2.3 阿膠酶解物的分離
2.3.1 離子交換色譜分離 稱取約100 g 離子交換纖維素，預處理後裝填於色譜柱（3 cm×35 cm），以去離子水平衡色譜柱。取500 mg幹燥阿膠酶解物溶於2 mL去離子水，上樣，以0～0.5 mol·L-1 NaCl溶液梯度洗脫，流速1 mL·min-1，檢測波長220 nm；在線檢測洗脫液吸光度，按色譜峰接收流分，將收集到的樣品分別記作IEC，1～IEC，3，分別測定其抗氧化活性，優選出IEC，2進行下一步分離。
2.3.2 凝膠過濾色譜分離 Sephadex G，25凝膠過濾柱（3 cm×50 cm），以10%甲醇平衡，取500 mg IEC，2（含NaCl）溶於2 mL去離子水，上樣，以10%甲醇洗脫，流速1 mL·min-1，波長220 nm；按色譜峰接收流分，將收集到的樣品分別記作GFC，1～GFC，3，選其活性最高者GFC，1進行LC，ESI，MS/MS鑒定。
2.4 LC，ESI，MS/MS鑒定
2.4.1 色譜及質譜條件 Zorbax SB C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm），流動相A，水（含0.1%三氟乙酸），B，乙腈（含0.1%三氟乙酸）；梯度洗脫，0～15 min，2%～10%B；15～50 min，10%～25%B；50～80 min，25%～65%B；80～90 min，65%～90%B；進樣量80 μL；流速 0.7 mL·min-1；檢測波長 214 nm。ESI電噴霧離子源，噴霧電壓4.5 kV，加熱電壓25 V，離子導入電壓20 V，殼氣流速20 L·min-1，輔助氣流速1.67 L·min-1，離子傳輸毛細管溫度 300 ℃。
2.4.2 質譜分析 質譜數據采用Turbosequest軟件進行檢索，數據庫為Swiss，Prot（含有驢的全部蛋白質的氨基酸序列），數據庫檢索時，掃描範圍m/z 400～2 000；多肽的信號強度 1×105；數據搜索格式為FASTA；多肽質量準確度±1.5；碎片離子的質量準確度±1.0。當搜索結果用如下參數過濾時產生的多肽被認為是陽性結果：當多肽帶電荷數為1時，Xcorr≥1.5，帶電荷數為2時，Xcorr≥2.0，帶電荷數為3時，Xcorr≥2.5，同時DeltaCn≥0.1。同時多肽二級質譜離子數量≥20，並綜合考慮目標離子色譜峰的信噪比以及二級質譜圖b離子，y離子之間的匹配性和連續性[15]。
3 結果與討論
3.1 阿膠氨基酸組成分析
阿膠中甘氨酸的含量為31.1%，脯氨酸的含量為11.3%，羥脯氨酸的含量為8.0%。檢測結果中存在羥脯氨酸表明樣品中含有膠原蛋白降解物，甘氨酸含量特征以及脯氨酸與羥脯氨酸比例和膠原蛋白的氨基酸組成特征十分接近，表明樣品中的主要多肽為膠原蛋白降解物，該研究與張貴鋒等人證明的阿膠主要成分為膠原蛋白降解後形成的多肽類物質的研究結果一致[16]。
表1 阿膠氨基酸組成測定結果
3.2 阿膠酶解物的生物活性測定
測得阿膠酶解物清除DPPH自由基IC50為3.0 g·L-1，陽性對照抗壞血酸清除DPPH自由基 IC50為20 mg·L-1；清除ABTS自由基IC50為0.70 g·L-1，陽性對照抗壞血酸清除ABTS自由基IC50為5.0 mg·L-1；清除羥基自由基IC50為1.0 g·L-1，陽性對照抗壞血酸清除羥基自由基IC50為9.1 mg·L-1。