3.3 阿膠酶解物的分離及各部位生物活性測定
阿膠酶解物的離子交換色譜分離圖譜，其中流分IEC，2抗氧化活性最高將其進行凝膠過濾色譜分離，所得流分中GFC，1活性最高，濃度為2.0 g·L-1時對DPPH清除率為47.95%，濃度為0.40 g·L-1時對ABTS清除率為97.20%。
3.4 GFC，1的質譜鑒定及分析
利用質譜對GFC，1所含多肽及其氨基酸序列進行分析，數據庫檢索結果中匹配係數（Xcorr）大於1.5的多肽。37.87 min的色譜峰為m/z 778.4的離子，提取離子流圖，一級質譜和Zoomscan掃描結果表明該離子帶單電荷，二級質譜掃描結果表明離子m/z 778.4對應多肽的氨基酸序列為GPAGPP*GPP*（P*為羥脯氨酸），其中第6位和第9位的脯氨酸發生的羥基化修飾。樣品中還檢測出許多其他多肽，這些多肽的氨基酸序列中含有多肽GPAGPP*GPP*，如m/z 849.4對應的多肽是AGPAGPP*GPP*，與GPAGPP*GPP*相比該多肽的N末端多出丙氨酸；m/z 835.4對應的多肽是GPAGPP*GPP*G，與GPAGPP*GPP*相比該多肽的C末端多出1個甘氨酸；m/z 906.4對應的多肽是AGPAGPP*GPP*G，與GPAGPP*GPP*相比，該多肽的C末端多出現1個甘氨酸，N末端多出1個丙氨酸。
羥脯氨酸是脯氨酸經羥基化修飾形成的產物，膠原蛋白序列中脯氨酸的羥基化修飾屬於蛋白質翻譯後修飾的一種，修飾程度與動物的年齡密切相關[17]；理論上，多肽混合物中應存在未發生羥基化修飾的多肽，樣品質譜分析結構中檢測出離子m/z 762.3，提取離子流圖，該離子的二級質譜，與GPAGPP*GPP對應，表明樣品中還存在隻有1個脯氨酸發生羥基化修飾的多肽。樣品中還存在其它多肽，這些多肽的氨基酸序列中也存在序列GPAGPP*GPP，由於質譜分析多肽的質荷比範圍的局限性以及多肽相對豐度的影響，在數據庫檢索結果中其Xcorr的分值較低，其可信度較低，結果中未列出這些多肽。
Kim等對魚皮經過酶解、分離純化後獲得了抗氧化肽，多肽的氨基酸序列中存在大量GPP，但也存在一定量的翻譯後修飾（GEP*GPP*GPP*GPP*GPP*G），並證明其具有抑製脂質過氧化作用。隨後Kim團隊又對牛皮進行抗氧化肽方麵研究，同樣發現了具有抑製脂質過氧化作用的肽段GPP*GPP*GPP*G[18，19]，魚皮和牛皮均為富含膠原蛋白的原料，所分離出的抗氧化肽皆具有GPP*結構。本研究中抗氧化活性較強部位GFC，1中也檢測到含GPP*序列的肽段，樣品的抗氧化作用可能與多肽含有較多的局部序列GPP*有關，GFC，1檢測出的肽段中許多含有天冬氨酸。Niranjan等在研究中提到天冬氨酸在一些抗氧化肽中扮演著重要角色，並且它在肽段中的位置與抗氧化活性無關[20]。此外，有研究認為含堿性氨基酸（賴氨酸、精氨酸、組氨酸）的活性肽可作為電子受體，奪取不飽和脂肪酸氧化形成的自由基的電子，從而阻斷因自由基引發的不飽和脂肪酸氧化鏈的延長[21]，而含組氨酸的肽又可作為金屬離子鼇合劑、單線態氧淬滅劑和·OH清除劑[22]，這些結果對研究GFC，1具有較強抗氧化活性的原因提供了參考。
3 討論
阿膠作為傳統經典中藥，其治療及保健作用廣受認可，但有效成分至今沒有確切的研究報道，從阿膠以膠原蛋白為主成分的屬性考慮，推斷其蛋白經消化酶解產生的肽類成分是起效的重要因素，本研究利用生物酶解技術將阿膠飲片（阿膠珠）水解，對獲得的阿膠低聚肽進行初步體外抗氧化活性考察，證明其具有體外清除自由基的功效；以抗氧化活性為篩選指標分離純化活性較高部位，應用多肽組學相關技術鑒定有效部位所含肽的氨基酸序列，已鑒定出9個結構確切的小分子肽，其中具有高重複核心序列GPAGPP*GPP*；將鑒定出的肽序列與文獻中已知的抗氧化肽序列進行匹對，發現部分肽段與牛皮、魚皮為原料獲取的抗氧化肽具有相同序列片段GPP*，並且具有已報道的能夠提高抗氧化活性的氨基酸殘基。實驗結果對阿膠抗氧化有效成分，阿膠的特征性鑒定及天然抗氧化肽方麵的研究具有一定的參考價值，對該部分所含肽的進一步分離、純化及活性考察有待深入研究。
[參考文獻]
[1] 中國藥典. 一部[S]. 2010：175.
[2] 錢超塵， 趙懷舟， 溫長路， 等. 金陵本《本草綱目》新校正.下冊[M]. 上海： 上海科學技術出版社， 2010： 1733.
[3] 毛跟年， 郭倩， 瞿建波， 等. 阿膠化學成分及藥理作用研究進展[J]. 動物醫學進展， 2010， 31（11）：83.
[4] 張嵐， 葛紅娟， 溫武略， 等. 酸漿宿萼總黃酮體外對羥基自由基的抑製作用[J]. 時珍國醫國藥， 2011， 22（8）： 1936.
[5] Bahareh H， Sarmadi， Amin I. Antioxidative peptides from food proteins [J]. Peptides， 2010， 31（10）：1949.
[6] Moure A， Dominguez H， Parajo J C. Antioxidant properties of ultrafiltration recovered soy protein fractions from industrial effluents and their hydrolysates [J]. Process Biochem， 2006， 41（2）：447.
[7] Nagai T， Suzuki N， Tanoue Y， et al. Antioxidant and antihypertensive activities of autolysate and enzymatic hydrolysates from yam （Dioscorea opposita Thunb.） ichyoimo tubers[J]. J Food Agric Environ， 2007， 5（1）： 64.
[8] Qian Z J， Jung W K， Kim S K. Free radical scavenging activity of a novel antioxidative peptide purified from hydrolysate of bull frog skin， Rana catesbeiana Shaw [J]. Bioresour Technol， 2008， 99（2）：1690.
[9] Chen H M， Muramoto K， Yamauchi F， et al. Antioxidative properties of histidine containing peptides designed from peptide fragments found in the digests of a soybean protein[J]. J Agric Food Chem， 1998， 46（1）：49.
[10] 胡軍影，程顯隆，肖新月，等. 阿膠的化學成分及質量評價方法研究進展[J]. 中國藥事，2007，21（3）： 193.
[11] 王棘， 戰祥友， 滕豔坤， 等. DNFB柱前衍生化RP，HPLC法測定氨肽素的氨基酸含量[J]. 沈陽藥科大學學報， 2003， 20（6）： 428.