2.3 方法學考察
2.3.1 精密度試驗 取同批虎耳草藥材（No.4）1 份，按 2.2.2項下方法製備供試品溶液，並且按 2.1項色譜條件重複進樣6次，各共有峰的相對保留時間和相對峰麵積的RSD分別為0.3%～1.6%，0.41%～1.5%，符合指紋圖譜的要求。
2.3.2 重複性試驗 取同批虎耳草藥材（No.4）6 份，分別按 2.2.1項下方法製備供試品溶液，並且按 2.1項色譜條件進樣，測定結果表明，各共有峰的相對保留時間和相對峰麵的RSD 分別為1.1%～2.41%，說明方法重複性良好。
2.3.3 穩定性試驗 取同1份供試品溶液，分別在0，3，6，12，24，36 h 按 2.1項色譜條件進樣，檢測其高效液相指紋圖譜。結果表明，各共有峰的相對峰麵積和相對保留時間的RSD 分別為0.46%～1.7%，0.73%～1.6%，說明樣品在36 h 內穩定。
2.4 貴州地區虎耳草藥材HPLC指紋圖譜的建立
精密稱定貴州省11批不同來源虎耳草藥材粉末2 g，按照 2.2.1方法製備供試品溶液，按 2.1項下色譜條件測定，得到11批不同來源虎耳草藥材色譜圖。與對照品圖譜比較，通過保留時間指認其中的1號峰為沒食子酸，保留時間為5.373 min； 3號峰為原兒茶酸，保留時間為10.220 min；4號峰為岩白菜素，保留時間為12.770 min；7號峰為對香豆酸，保留時間為29.597 min；8號峰為H，15，保留時間為32.420 min；11號峰為H，20，保留時間為47.717 min；13號峰為槲皮素，保留時間為65.717 min。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價係統”（2004年A版）生成虎耳草藥材指紋圖譜共有模式。以樣品（No.3）色譜圖S3為參照圖譜，中位數生成法，選取時間寬度為0.1 min ，得到對照用指紋圖譜。
色譜指紋圖譜相似度評價係統”（2004 A版），根據11批樣品相對保留時間及指紋圖譜的整體譜峰特點[6]，以相關係數法對樣品的相似度進行評價，各樣品相似度。
3 討論
3.1 提取方式的考察
分別考察了回流和超聲2種提取方式，對HPLC圖進行比較。結果二者HPLC圖基本一致，但是從主要峰的積分麵積可知，回流提取效率明顯高於超聲提取，所以優選回流提取作為提取方式。
3.2 提取溶劑的考察
分別以水、甲醇（100%，90%，80%，70%，60%，50%）、乙醇（100%，90%，80%，70%，60%，50%）為提取溶劑，回流2 h。HPLC圖進行比較可知，以60%乙醇提取時各色譜峰峰麵積大，故選擇60%乙醇作為優選提取溶劑。
3.3 粉末粒度大小的考察
分別對同批虎耳草藥材的粗粉，10，20，40目不同粒度進行考察。從主要峰的積分麵積可知，粉末粒度為10目時主要峰峰麵積最大，故選擇10目為最優粉末粒度。
3.4 料液比的考察
分別對料液比為1：8，1：10，1：12，1：14，1：16 進行考察。從HPLC圖比較可知，料液比從1：12以後，隨料液比的增加，對主要峰峰麵積幾乎無影響，所以選擇以12倍量的溶劑體積為最優溶劑用量。
3.5 提取溫度、時間、次數的考察
分別對70，80，90 ℃不同溫度進行考察。結果一些主要峰受溫度影響較大，但80 ℃時，主要峰的積分麵積總值最大，故選取80 ℃為最優提取溫度。
分別對回流1，2，3 h 進行考察。結果顯示，回流2 h 主要峰的積分麵積總值大於回流1 h，但回流時間增加對主要峰的積分麵積總值幾乎無影響，故以2 h 為優選回流時間。
分別對提取1，2，3次進行考察。結果顯示，提取次數對各主要峰的影響不大，從方便、省時、節能等方麵考慮，優選提取1 次。
3.6 萃取次數的考察
分別對萃取3，4，5，6次進行考察。隨著萃取次數的增加，主要峰的積分麵積總值逐漸增大，但萃取次數大於5次後，隨著萃取次數的增加，主要峰的積分麵積總值增加很少，故優選萃取次數為5次。
3.7 色譜柱的選擇
考察了不同色譜柱：Diamonsil C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）、依利特 Hypersil ODS2 （ 4.0 mm×250 mm， 5 μm）、phecda C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm） 。在相同色譜條件下，Diamonsil C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm） 的分離度較好，且基線平穩，故選擇Diamonsil C18色譜柱進行虎耳草指紋圖譜的檢測。
3.8 色譜流動相的選擇
對甲醇，水、甲醇0.05%磷酸水、乙腈，水和乙腈，0.05%磷酸水4組流動相係統進行篩選，結果表明乙腈，0.05%磷酸水係統進行梯度洗脫效果最佳，采用該係統各色譜峰的峰型和分離度較好，且基線平穩，故選定該係統作為虎耳草乙酸乙酯部位指紋圖譜檢測的流動相。
3.9 柱溫的選擇
考察了25，30，35 ℃柱溫對色譜分離的影響，結果顯示，溫度為30 ℃時，可達到較好的分離效果，故選擇柱溫為30 ℃。
3.10 檢測波長的選擇