於是，他連忙找張曉樓教授了解臨床上青、鏈黴素治療沙眼的效果。隨後又趕緊查閱各種中外文資料，了解國內外臨床上應用這兩種抗菌素治療沙眼的情況，從中得到一個深刻的印象：鏈黴素治沙眼基本無效，說明它對沙眼病毒沒有威脅，還可繼續使用；而青黴素治沙眼的療效則說法不一。但一本叫《人的病毒病》的英文書卻比較肯定青黴素可控製沙眼症狀的發展，於是他把注意力集中到青黴素上，將其用量果斷地減少到原來的五分之一，結果一下子就分離出了沙眼病毒。時為1956年6月12日。
隻有一次分離成功，還不能作為依據。湯飛凡又做了一次完全不用青黴素而用鏈黴素且用量增加一倍的分離，也在同年7月取得成功，8月初又分離成功。兩年以後，英國等許多國家也紛紛報道用這種分離法取得了沙眼病毒。
1956—1957年，湯飛凡、張曉樓合作發表了他們包括上述成果在內的對沙眼病毒的一係列研究成果：《沙眼包涵體的研究》等幾篇重要論文。
為了使沙眼病毒在人眼內得到驗證，1958年1月2日，湯飛凡讓張曉樓把分離出的病毒給他注入眼內試驗。“如果科學研究需要用人作試驗，科學研究人員就要首先從自己做起。”這是湯飛凡的原則和格言，他以前也是這麼做的。例如，早在30年代他同周城滸合作，將日本學者野口矢認為的“沙眼杆菌”注入過自己的眼內試驗。這次沙眼病毒注入他眼內所呈現的症狀，正是典型的沙眼病者的症狀。從此，半個世紀以來人們對沙眼病毒的疑惑結束了。湯飛凡1958年《關於沙眼病毒形態學，分離培養和生物學性質的研究》等論文，為沙眼病原的研究揭開了新的曆史性的一頁。
沙眼病毒分離成功的消息傳遍了全世界，許多著名生物學家對這一填補微生物學空白的成就表示祝賀，被稱為“湯氏病毒”的名詞代替了“沙眼病毒”，其成果被大量引用，有的還編入教材，有人將其視為1958年醫學十大成果之一，應寫入年鑒，載入史冊。1981年5月11日，國際沙眼防治組織在巴黎舉行了隆重的儀式，授予湯飛凡和張曉樓金質獎章。
1958年9月30日，湯飛凡去世。李約瑟博士在致湯飛凡的悼詞中說：“我榮幸地結識了你們國家這樣一位傑出的科學公仆。……他是絕不會被忘記的。”
是的，湯飛凡這位中國微生物學的奠基者和國際著名的微生物學家以其崇高的科學美德、科學的獻身精神，連同他的諸多成就被人們永遠銘記在心。他的科研方法啟迪著我們在科學道路上前進。
在發明電報的科學家貝爾的塑像下，有句關於機遇發現的名言：“有時需要離開常走的大道，潛入森林，你就肯定會發現前所未有的東西。”這也是湯飛凡作出上述重大貢獻所用的科研方法的最好注釋。