李時珍都非常注意觀察藥物的形態和生長情況。為了能仔細觀察到毒蛇的原生態。李時珍置危險於度外，到處尋找。在捕蛇人的幫助下，終於近距離觀察了毒蛇，並看到了捕蛇、製蛇的全過程。由於這樣深入實際調查過，後來他在《本草綱目》寫的時候，就得心應手，說得簡明準確。同時李時珍了解藥物，並不滿足於走馬看花式的調查，而是一一采視，對著實物進行比較核對。這樣弄清了不少似是而非、含混不清的藥物。太和山五龍宮產的“榔梅”，被道士們說成是吃了可以長生不老，人們把它稱作“仙果”。宮廷的貴族都把它當作寶貝一樣，要地方官吏年年進貢，並且禁止百姓采摘。李時珍不信道士們的鬼話，要親自采來試試，看看它究竟有什麼攻效。為了弄清真相，他冒著危險，攀登懸崖峭壁，采到了一顆榔梅，帶回家鄉。經過他詳細研究，才知道那種果子隻不過像一般梅子一樣，有生津止渴的作用，是一種變了形的榆樹的果實，並沒有什麼特殊功效。
本著嚴謹的治學態度，李時珍腳穿草鞋，身背藥簍，帶著學生和兒子翻山越嶺，訪醫采藥，足跡，以及牛首山、攝山、茅山、太和山等大山名川，走了上萬裏路，傾聽了千萬人的意見，參閱各種書籍800多種，前後曆經27年，終於在他61歲那年（1578年）寫成《本草綱目》一書。
《本草綱目》共16部，52卷，約190萬字。全書藥物1518種，在前人基礎上增加藥物374種，共計1892種，其中植物1195種；收錄古代藥學家和民間藥方11096則；書前附藥物形態圖1100餘幅。這部偉大的著作，對曆代本草著作去粗取精去偽存真，在此基礎上糾正了以前的錯誤，補充了不足，並有很多新發現和突破。是到16世紀為止我國最係統、最完整、最科學的一部醫藥學著作。
全書如此浩瀚廣博大，如何分類檢索便成為關鍵的問題。而李時珍最大的貢獻之一，就是他不僅成功解決了藥物的方式、檢索等問題，而且從體現了他對植物分類學方麵的新見解，以及具有啟蒙意義的生物進化發展思想。李時珍打破了自《神農本草經》以來，傳統的上、中、下三品分類法，把藥物分為水、火、土、金石、草、穀、萊、果、木、器服、蟲、鱗、介、禽、獸、人共16部，包括60類。每藥標正名為綱，綱之下列目，綱目清晰。書中還係統地記述了各種藥物的知識。包括校正、釋名、集解、正誤、修治、氣味、主治、發明、附錄、附方等項，從藥物的曆史、形態到功能、方劑等，敘述甚詳。尤其是“發明”這項，主要是李時珍對藥物觀察、研究以及實際應用的新發現、新經驗，這就更加豐富了本草學的知識。
李時珍於1593年逝世，享年75歲。李時珍逝世後遺體被安葬在故鄉蘄州城東。到時至今日天為止，蘄州一帶的中醫每年清明都要到墓地拜祭朝拜，當地許多人常把他墳頭的青草采回家中以消災滅病。李時珍一生著述頗豐豐富，除代表作《本草綱目》外，還著有《奇經八脈考》、《瀕湖脈學》、《五髒圖論》等十種著作。李時珍是我國古代具有代表性的傑出科學家。時至今日，人們對李時珍的研究現在仍在不斷地深入發展。