1875年，巴甫洛夫以優異的成績畢業並獲得自然科學碩士學位。齊昂教授早已看中這位才華出眾的青年，他聘請巴甫洛夫到自己主持的外科醫學院（後改名為軍事醫學院）生理學研究室任助教。1876年巴甫洛夫又去了這個學院獸醫學部生理實驗室任實驗員，他在烏斯齊莫維奇教授的領導下，開始進行血液循環生理學的研究。
1878年，巴甫洛夫接受了俄國著名臨床醫學家彼·鮑特金教授的邀請，在他診所的實驗室進行研究工作。在這裏，他主要研究血液循環、消化生理、藥理學方麵的問題。1879年，他做了第一個著名的手術，在胰腺裏裝一個固定的瘺管。因科學研究成績出色，又一次獲金質獎章，以後經考試合格又留院深造兩年，繼續在鮑特金實驗室工作。巴甫洛夫自進入這個實驗室就是領導者，他在實驗室裏擔任青年進修醫師的指導老師，十多年富有成效的辛勤工作，為他奠定了成為一名卓越生理學家的基礎。
1881年，巴甫洛夫與學教育的卡爾捷夫斯卡婭結婚，由於生活拮據，為節省開支，巴甫洛夫不得不把妻子送到農村的姐姐家中。
1883年，巴甫洛夫寫了《論心髒的離心神經》博士論文，同年5月21日進行論文答辯，順利通過並獲得醫學博士學位。1884年，任彼得堡大學生理學講師。
1888年，他發現了調節胰腺分泌活動的神經，完成了著名的“假飼實驗”。1889年，他做了第二個有名的手術即食道手術。由於這些成就，巴甫洛夫不僅在國內，而且在國外也有聲譽。1890年4月24日，巴甫洛夫被任命為軍事醫學院藥理學副教授。1891年，又兼任新成立的實驗醫學研究所生理學部主任，組織與領導生理學的研究工作。1897年，出版了《關於主要消化腺工作講義》，這是巴甫洛夫一生中的重要著作之一，先後被譯成幾國文字，成為生理學研究的指南。
1904年，巴甫洛夫獲諾貝爾生理學和醫學獎，以表彰他在消化係統生理學方麵取得的開拓性的研究成就。他是俄國第一個榮獲諾貝爾獎的科學家，也是世界上第一個獲得諾貝爾獎的生理學家。
從1904年，到他逝世前三十餘年間，巴甫洛夫轉向大腦皮層的生理研究。在蘇聯政府和列寧的直接關懷下，1923年，他出版了《二十年來對動物進行高級神經活動的客觀研究的實驗》專著，這是一部浸透著巴甫洛夫研究心血的結晶。1927年，他又出版了《大腦兩半球工作講義》。
1924年蘇聯科學院為他新建了一個以他的名字命名的生理學研究所。1929年，又在列寧格勒附近的科爾托村為他建立了一個世界上獨一無二的生理學研究中心——巴甫洛夫村。
1936年2月27日，這位偉大的生理學家因患流感性肺炎逝世。在他逝世前不久，他還時刻不忘未來的祖國建設者，他熱情洋溢地給蘇聯青年寫了封信，信中寫道：“循序漸進，循序漸進，再循序漸進。……”等名言。我們雖然失去了這位科學巨人，但他留下的精神財富卻取之不盡。
學術成就
巴甫洛夫在生理學領域中的研究十分廣泛，涉及生理學的各個部分，集中體現在三個方麵：
血液循環生理學、消化係統生理學、高級神經活動生理學和大腦生理學。
（一）血液循環生理學
巴甫洛夫從事血液循環生理學的研究是在他開始科學研究工作的最初15年（1874年～1888年），也就是在鮑特金臨床病理實驗室工作期間。他創造並應用了一種全新的生理學實驗法，這種實驗法稱慢性實驗法，與傳統的急性實驗法相區別。
在當時，生理學家普遍以孤立的、靜止的觀點來研究動物的一些器官的生理功能。他們利用物理和化學的方法，從活著的或死去的動物身上取下研究對象，置於人工環境下，設法在短時間內保持它的生理機能，對其進行實驗；或用麻醉劑、破壞大腦等方法使動物失去知覺和生存能力，再進行解剖，觀察研究對象的機能，這種實驗方法稱為急性實驗法，又稱分析實驗法。
巴甫洛夫不太欣賞急性實驗方法，認為這種實驗方法破壞了動物的整體性，具有一定的局限性。他創造了一種慢性實驗法來彌補急性實驗法的不足。所謂慢性實驗法就是在正常的、未經麻醉的、健康的動物身上進行研究的方法。巴甫洛夫耐心地訓練動物，使它們能在實驗台上安靜地忍受複雜的實驗手術，這樣動物在完全清醒和正常的條件下被研究，整個中樞神經係統很正常，因此所得的結果能完全反映出在整體內所研究的器官與各種係統保持複雜的相互關係時的活動情況。例如，他在清醒的動物身上剖開動脈，連上血壓計，記錄血壓，探討調節血壓的機製。