優點:經濟、簡便、雞胚易得
缺點:
①有些雞胚帶有母源抗體
②也可能帶有病毒
③很多病毒在雞胚中不生長
2.2.3 細胞培養:
①將離體活組織塊或分流的活細胞加以培養統稱為組織培養,後者又稱單層細胞培養。
②細胞培養適於絕大多數病毒生長,是病毒實驗室的常規技術。
細胞培養的特點:
(1)細胞的生理特性基本一致
(2)對病毒的感染性一致
(3)沒有實驗動物的個體差異
(4)重複性好
(5)與實驗動物相比,通過觀察細胞病變或結合免疫學技術檢測判斷結果。
(6)可通過病毒細胞培養產生的空斑進行克隆純化病毒。
細胞培養的類型
根據細胞的來源、染色體特征及傳代次數,可分為三種類型:
(1)原代細胞
(2)二倍體細胞株
(3)傳代細胞係
原代細胞:
①動物新鮮離體組織塊(剪成小塊)經胰蛋白酶消化、分散,獲得單個細胞,再生長與培養器皿中。
②有人把培養的第 1 代細胞與傳 10代以內細胞統稱為原代細胞。
③分離病毒最為敏感,尤其是本動物的原代細胞。
二倍體細胞株:
①將長成的單層原代細胞消化分散成單個細胞繼續培養傳代,其染色體數與原代細胞一樣保持其二倍體型的染色體,稱為二倍體細胞。
②如:豬腎細胞係(PK-15)、犬腎細胞係MDCK。
③可傳至一百代左右
④用於病毒分離和疫苗製備
傳代細胞係:
①能在體外持續增殖傳代的細胞係,大多數由癌細胞或二倍體細胞突變而來
②方便易得
③用於病毒的分離鑒定和抗病毒藥物篩選研究。
常用的細胞培養類型
原代細胞:恒河猴腎細胞、人胚腎、肺等細胞,雞胚成纖維細胞
二倍體細胞株:豬腎細胞係(PK-15)、恒河猴胚細胞株(HL-8)、犬腎細胞係
傳代細胞係:Hela 細胞、Detroit 細胞(胸骨髓細胞係),Chang C\/I\/L\/K(人結膜 C、腸 I、肝 L 與腎 K 細胞係),Vero(綠猴腎細胞係),BHK-21(幼地鼠腎細胞係)
3.病毒理化特性的測定
(1)病毒核酸型鑒定(單股\/雙股 DNA\/RNA 正鏈\/負鏈 新病毒→逐漸縮小範圍)
①鹵化核苷酸法→檢測為 DNA 還是 RNA 病毒
②放線菌素 D 法
③吖啶橙(AO)染色法
④綠豆芽酶:
該酶可降解單核酸,可以測定核酸的股數
(2)耐酸性試驗
(3)脂溶性試驗
(4)耐熱性試驗等
4.病毒的血清學和分子生物學鑒定
①病毒分離後,可用已知的抗病毒血清或單克隆抗體,對分離毒株進行血清學鑒定,已確定病毒的種類、血清型及其亞型。
②分子生物學技術鑒定病毒
第二節 病毒感染單位的測定
①測定樣本中病毒的濃度,即病毒的滴度是病毒學中最重要的技術之一。
②病毒滴度可以通過用稀釋的病毒接種細胞培養、雞胚或實驗動物,檢測其增殖情況而確定。
③常用於病毒滴度測定的技術有空斑試驗、終點稀釋法等。
終點稀釋法:
(1)用途:
①測定病毒滴度
②確定病毒對動物的毒力或毒價
(2)方法:
將病毒做係列稀釋,選 4~6 個稀釋度,接種一定數量的細胞、雞胚或動物,每個稀釋度做 3~6 個重複
→問 TCID50、ID50、LD50、ELD50、EID50
第三節 病毒顆粒的檢測
①電鏡技術常用於直接檢測病毒顆粒
②用血凝試驗和病毒酶活性測定
電鏡技術:
①最直觀觀察病毒顆粒的方法。但 EM 檢測樣本中必須有一定量的病毒顆粒,如少於 107\/ml 則不易檢出
②可用磷鎢酸鹽等重金屬鹽直接做負染而後觀察,適用於觀察病毒表麵結構。
③器官組織樣本則須做超薄切片後再做負染觀察。可觀察細胞內的病毒結構,如冠狀病毒、逆轉錄病毒在組織中出芽的病毒顆粒等。