微生物知識點(35)(2 / 2)

優點:經濟、簡便、雞胚易得

缺點:

①有些雞胚帶有母源抗體

②也可能帶有病毒

③很多病毒在雞胚中不生長

2.2.3 細胞培養:

①將離體活組織塊或分流的活細胞加以培養統稱為組織培養,後者又稱單層細胞培養。

②細胞培養適於絕大多數病毒生長,是病毒實驗室的常規技術。

細胞培養的特點:

(1)細胞的生理特性基本一致

(2)對病毒的感染性一致

(3)沒有實驗動物的個體差異

(4)重複性好

(5)與實驗動物相比,通過觀察細胞病變或結合免疫學技術檢測判斷結果。

(6)可通過病毒細胞培養產生的空斑進行克隆純化病毒。

細胞培養的類型

根據細胞的來源、染色體特征及傳代次數,可分為三種類型:

(1)原代細胞

(2)二倍體細胞株

(3)傳代細胞係

原代細胞:

①動物新鮮離體組織塊(剪成小塊)經胰蛋白酶消化、分散,獲得單個細胞,再生長與培養器皿中。

②有人把培養的第 1 代細胞與傳 10代以內細胞統稱為原代細胞。

③分離病毒最為敏感,尤其是本動物的原代細胞。

二倍體細胞株:

①將長成的單層原代細胞消化分散成單個細胞繼續培養傳代,其染色體數與原代細胞一樣保持其二倍體型的染色體,稱為二倍體細胞。

②如:豬腎細胞係(PK-15)、犬腎細胞係MDCK。

③可傳至一百代左右

④用於病毒分離和疫苗製備

傳代細胞係:

①能在體外持續增殖傳代的細胞係,大多數由癌細胞或二倍體細胞突變而來

②方便易得

③用於病毒的分離鑒定和抗病毒藥物篩選研究。

常用的細胞培養類型

原代細胞:恒河猴腎細胞、人胚腎、肺等細胞,雞胚成纖維細胞

二倍體細胞株:豬腎細胞係(PK-15)、恒河猴胚細胞株(HL-8)、犬腎細胞係

傳代細胞係:Hela 細胞、Detroit 細胞(胸骨髓細胞係),Chang C\/I\/L\/K(人結膜 C、腸 I、肝 L 與腎 K 細胞係),Vero(綠猴腎細胞係),BHK-21(幼地鼠腎細胞係)

3.病毒理化特性的測定

(1)病毒核酸型鑒定(單股\/雙股 DNA\/RNA 正鏈\/負鏈 新病毒→逐漸縮小範圍)

①鹵化核苷酸法→檢測為 DNA 還是 RNA 病毒

②放線菌素 D 法

③吖啶橙(AO)染色法

④綠豆芽酶:

該酶可降解單核酸,可以測定核酸的股數

(2)耐酸性試驗

(3)脂溶性試驗

(4)耐熱性試驗等

4.病毒的血清學和分子生物學鑒定

①病毒分離後,可用已知的抗病毒血清或單克隆抗體,對分離毒株進行血清學鑒定,已確定病毒的種類、血清型及其亞型。

②分子生物學技術鑒定病毒

第二節 病毒感染單位的測定

①測定樣本中病毒的濃度,即病毒的滴度是病毒學中最重要的技術之一。

②病毒滴度可以通過用稀釋的病毒接種細胞培養、雞胚或實驗動物,檢測其增殖情況而確定。

③常用於病毒滴度測定的技術有空斑試驗、終點稀釋法等。

終點稀釋法:

(1)用途:

①測定病毒滴度

②確定病毒對動物的毒力或毒價

(2)方法:

將病毒做係列稀釋,選 4~6 個稀釋度,接種一定數量的細胞、雞胚或動物,每個稀釋度做 3~6 個重複

→問 TCID50、ID50、LD50、ELD50、EID50

第三節 病毒顆粒的檢測

①電鏡技術常用於直接檢測病毒顆粒

②用血凝試驗和病毒酶活性測定

電鏡技術:

①最直觀觀察病毒顆粒的方法。但 EM 檢測樣本中必須有一定量的病毒顆粒,如少於 107\/ml 則不易檢出

②可用磷鎢酸鹽等重金屬鹽直接做負染而後觀察,適用於觀察病毒表麵結構。

③器官組織樣本則須做超薄切片後再做負染觀察。可觀察細胞內的病毒結構,如冠狀病毒、逆轉錄病毒在組織中出芽的病毒顆粒等。