標記紫萁小菇及同化標記物在天麻種胚中的運輸途徑
蘭進 賀秀霞 湯以佳 徐錦堂 朱永懿（中國醫學科學院中國協和醫科大學藥用植物研究所，北京，100094；。中國農業科學院原子能利用研究所，北京，100094）
摘要：
用3H-葡萄糖對紫萁小菇進行氚標記，然後用標記的紫萁小菇伴播天麻種子，觀察發現標記紫萁小菇僅由天麻胚柄狀細胞侵入，在天麻種胚細胞中同化的標記化合物由細胞壁進入並由胞壓運輸到細胞內，形成原球莖後同化標記物由維管組織運輸。
關鍵詞：天麻種子；標記紫萁小菇；放射性自顯影
前言天麻屬蘭科非自養型植物。其種子構造簡單，無胚乳及其它營養貯備，僅由胚及種皮構成。研究發現天麻種胚細胞中含有一些多糖及脂肪等營養物質，但不足以提高種子萌發的營養。試驗證明，無外源營養供給，天麻種子不能發芽，蜜環菌對天麻種子萌發有明顯的抑製作用。徐錦堂等從天麻發芽原球莖中分離到12種可供天麻種子發芽的萌發菌菌株，其中確認紫萁小菇菌是最優良的一種，這一突破性的進展，使天麻種子發芽率提高30～40％。天麻有性繁殖研究也進入了一個新階段。徐錦堂等利用光學顯微鏡及電子顯微鏡對天麻消化紫萁小菇的過程進行了大量觀察研究。這些工作多是建立在雙方相互作用解剖特征基礎上，缺少對作用雙方物質運輸途徑的研究。本文在前人研究基礎上，采用連續切片進行光鏡放射性自顯影觀察，追蹤標記紫萁小菇及同化產物在天麻種胚中的軌跡，了解標記物在天麻種胚及原球莖中積累運輸情況，為係統地揭示天麻生長發育規律提供理論依據。
1.材料與方法
1.1材料同位素標記化合物3H-葡萄糖［D-（6-3H-glu）］，由中國科學院上海核技術研究所提供，比活度30Ci／mmol。
1.2方法
1.2.1菌種標記
培養母種菌種培養：配製PDA培養基。馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，水1000ml，按常規配製，pH5.5。經高壓滅菌後，在無菌條件下，將培養基分裝無菌試管中，每管2 ml，25℃放置2d。無菌條件下溶化加入3H-葡萄糖，引入劑量50μg／ml，搖勻，擺成斜麵培養基。用60Coγ輻照滅菌。25℃培養2d，確認無雜菌汙染後，接入紫萁小菇菌種，25℃培養，15d後轉接二級菌種。樹葉菌種培養：將青杠樹落葉洗淨，擺放到培養皿中的海棉上，加水，高壓滅菌後，接入標記的一級菌種，25℃培養，20d後可播種。
1.2.2標記
紫萁小菇伴播天麻種子實驗所用天麻種子采自藥用植物研究所真菌室經人工授粉結的果實。在無菌條件下，將天麻果抖出種子，播種到染有紫萁小菇的菌葉上。
1.2.3樣品製備
光鏡樣品製備：取被標記紫萁小菇侵染的天麻種子及由種子萌發形成的原球莖，用水反複衝洗。用5O% EDTA浸洗2min，再流水衝洗。分別用FAA液固定24h，經清洗，係列梯度酒精脫水，浸蠟，石蠟包埋，常規石蠟切片，切片厚度7～8μm。切片經禱片、脫蠟、複水後，移入暗室塗布乳膠。自顯影製備：暗室紅燈下，取定量的核-4乳膠（北京401研究所研製），置於無離子水洗淨的乳膠杯中，以一定濃度水楊酸鈉溶液作增感劑，在42℃恒溫水浴中攪拌15min，靜止片刻。在乳膠塗布箱中，用塗布法在已脫蠟的切片上塗布核乳膠膜，晾幹，置切片於暗盒中，加矽膠幹燥袋，密封，置4℃冰箱中曝光20d。顯影、定影：切片曝光後，用D—19b顯影液顯影3min，停影後，用F—5酸性堅膜定影液定影20min，流水衝洗，稍晾幹，經係列梯度酒精脫水，同時用番紅一固綠二重染色，最後，用光學樹脂封片，待觀察。
2.結果與分析標記
紫萁小菇伴播天麻種子後，在菌絲侵入初期，標記物大量集中分布於天麻胚柄狀細胞中，表明紫萁小菇菌絲僅由天麻胚柄狀細胞侵入胚體，標記菌絲形成菌絲結出現在胚柄狀細胞上部2～3層原胚細胞中，同時發現顯影銀粒在胚柄狀細胞以上的原胚細胞和頂端分生細胞中，在原胚細胞中顯影銀粒多分散在多糖顆粒上，表明胚柄狀細胞上部2～3層原胚細胞具有消化、分解萌發菌的能力並將其同化產物通過細胞壁及胞壓運輸到上部原胚細胞及頂端分生細胞中。觀察還發現在胚柄狀細胞上部4～5層原胚細胞中，不形成菌絲結，紫萁小菇菌絲被完全消化，在這些細胞中有大量顯影銀粒存在，在胚頂上層原胚細胞分解、消化吸收，被同化的標記物由胞壓作用，通過細胞間傳遞達到頂端分生細胞中。分生細胞獲得營養，分裂旺盛，胚體膨大，突破種皮而萌發，形成原球莖。原球莖分化產生營養繁殖莖，並分化出維管組織，在新形成的維管組織中發現大量顯影銀粒，表明隨著種胚的發育，維管組織的形成，天麻種胚消化萌發菌獲得的營養物質是通過維管組織進行運輸，以滿足其生長的需要。
3.討論
通過放射性自顯影觀察標記紫萁小菇同化物的蹤跡，表明天麻胚柄狀細胞具有分解、消化菌絲的功能，當分生細胞開始分裂後，種胚頂端分生組織中已雲集大量同化的標記化合物，在天麻種胚沒有形成原球莖前，同化紫萁小菇的營養物質靠細胞壁及胞壓作用，進行傳遞和輸送，當頂端分生細胞開始分裂，突破種皮而萌發，形成原球莖，隨著組織的分化，同化標記物由維管組織運輸，從理論上進一步證明天麻種子萌發靠同化侵入的紫萁小菇獲得營養。在新形成的營養繁殖莖維管組織中也發現了許多顯影銀粒，說明紫萁小菇不僅在天麻種子發芽及原球莖形成時供給營養，而在分化出營養繁殖莖及營養繁殖莖生長階段，都需要從萌發菌獲得營養。這些同化的標記物如何參與天麻種子萌發與原球莖形成的新陳代謝過程及其超微結構的變化還有待於借助電子顯微鏡放射性自顯影技術進一步觀察研究。