黃果及紅果人參、西洋參基因組的RAPD分子標記研究
任躍英1王軍軍2王罡2.（1吉林農業大學中藥材學院，吉林，130118；。2中國人民解放軍軍需大學植物基因工程中心，吉林，130062）
摘要：
利用RAPD技術，對人參屬（Panax）黃果人參、紅果人參，黃果西洋參及紅果西洋參進行了分析。共采用15個隨機引物，其中14個引物的擴增帶型在不同品種間出現差異，共擴增出131條帶，多態性達59.5%。應用SPSS9.0統計軟件對RAPD擴增結果進行聚類分析，構建係統發育樹狀圖，結果表明，人參與西洋參各自聚為一支，彼此遺傳距離較遠，黃果西洋參與紅果西洋參、黃果人參與紅果人參遺傳距離均較近，但也存在著一定程度的核苷酸序列差異。RAPD及聚類分析結果與形態學和細胞學等分析結果基本一致，證實了RAPD分析方法是人參屬係統分類、品種鑒定的有效方法。
關鍵詞：人參；西洋參；RAPD分析；親緣關係；聚類分析
五加科人參屬植物西洋參，人參均為享有盛名的珍貴藥用植物。為了進行人參屬植物的分類研究，先後從形態特征、組織解剖、農藝性狀、抗逆抗病性、生理生化、染色體核型、種皮紋飾、化學成分、遺傳分析、RAPD分子指紋技術、同工酶、變異情況調查等方麵進行了研究。但對黃果及紅果人參、西洋參基因組的RAPD分子標記研究未見報道。
由於RAPD技術是在基因組DNA水平上隨機進行擴增，所檢測的位點在基因組中隨機分布，因而可以更客觀地說明群體遺傳多樣性的水平。自二十世紀90年代以來，該技術已被廣泛地應用於種間、品種間、亞種、居群或不同基因組間的分類、遺傳和進化關係等方麵的研究。如利用RAPD分析研究發現人參種內有較豐富的遺傳多樣性。本文選用黃果、紅果人參，黃果、紅果西洋參進行RAPD分析，旨在為親緣關係分類及新品種鑒定提供新的分子證據，並為該屬植物種質資源的保護和利用提供科學依據。
1.材料和方法
1.1實驗材料
本研究供試的西洋參黃果和紅果植株的4年生新鮮冰凍的葉片由中國科學院左家特產研究所提供，供試的人參黃果和紅果植株的4年生新鮮冰凍的葉片由吉林農業大學西洋參場提供，具體來源及植株數。其中黃果紅果人參、黃果紅果西洋參每一擴增反應取 0.3g幼嫩葉片用於DNA提取。
1.2實驗試劑
隨機引物為上海癌細胞研究所及大連寶生物公司產品，Taq DNA 聚合酶、dNTP為北京鼎國生物技術公司產品，引物及其序列。
1.3DNA提取
采用北京鼎國生物技術公司的植物基因組DNA提取試劑盒，操作步驟參照其說明書。
1.4RAPD擴增RAPD反應為25μl體係，包括如下試劑：
10×PCR buffer（20mmol/L MgCl2）2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2.0μL，Taq DNA 聚合酶1U、隨機引物40ng，基因組DNA80ng。擴增反應在Biometra公司生產的LINOⅡ型 PCR儀上進行，程序為：94.0℃，3min+（94.0℃，1min+38.0℃，1min+72.0℃）×45+72.0℃，10 min。擴增產物檢測：取RAPD反應液10μL於1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，經EB染色，在紫外透射儀上觀察並拍照。擴增產物長度與100bp DNA ladder標記物比較。
1.5聚類分析
1.5.1反應條帶的觀察及統計
電泳圖譜中每一條帶均代表了引物與膜板DNA互補的一對結合位點，可記為一個分子標記，根據分子量標準對照反應產物在膠上的對應位置，估計擴增產物的分子量大小。PCR擴增反應重複一次，選取可重複的DNA帶記錄，有帶的記為1，無帶的記為0，形成0/1矩陣圖的原始數據輸入計算機。1.5.2數據分析應用SPSS9.0統計軟件對擴增結果進行聚類分析。
2.結果與分析
2.1RAPD擴增結果
本實驗應用15個隨機引物對黃果人參、紅果人參；黃果西洋參、紅果西洋參進行RAPD擴增，結果有14個引物擴增出DNA多態性條帶，所得擴增結果。其中P2 P12 P16，OPR0.5，CCD142-03，5個引物在人參和西洋參之間產生多態性條帶；P1、P3、P6、P7、P8、P13、CCD142-01，6種引物在紅果西洋參和黃果西洋參之間產生多態性；P4、P7、P8、P11、P13、CCD142-01，6種引物在紅果人參和黃果人參之間產生多態性；而P7、P8、P13、CCD142-014種引物則可將4個品種完全區別開，如圖1，為P7引物的RAPD擴增結果。本實驗擴增所分離的多態性條帶重現性穩定，因而可作為特異的分子標記用於品種之間的區分和鑒定。