清光緒二十五年（1899年）初，周樹人再次離家到南京，改考江南陸師學堂。恰巧在陸師學堂開辦了礦路學堂，其性質與“格致書院”相似，因為附設在陸師學堂，故名稱不叫書院而叫礦路學堂。周樹人不能成為正式陸軍學生，而是進入了礦路學堂。
礦路學堂創辦於清光緒二十一年（1895年），是洋務派張之洞仿照德國體製搞起來的。他認為陸軍與鐵路有特殊關係，便在陸師學堂下設置一所鐵路學堂。後來，劉坤一接任，聽說南京附近的青龍山有蘊藏量豐富的煤礦，開煤礦非常有利可圖，便決定在學堂裏設置礦務班，培養一批具有開礦專門知識的人才。於是，便形成了礦路學堂。
礦路學堂的課程重點在開礦，以鐵路為輔，開設有算學、格致（物理與化學）、金石學（礦物學）、地學（地質學）、曆史等課程。這些課程，對周樹人來說，一些自然科學初次接觸，實在是非常新鮮。雖然畫鐵軌斷麵圖什麼的有些麻煩，但他過去是善長畫畫的。當時金石學有江南製造局的《金石識別》可用，地學卻是要用手抄本的，他發揮了舊日影寫畫譜的本領，非常精細地照樣子抄寫了一部。
在礦路學堂學習期間，周樹人學習十分勤奮刻苦。他在班上年齡最小，而成績卻是最好的。學堂裏有規定，每月考試一次，考第一名的學生可以得到一枚三等銀牌，有了四枚三等銀牌可以換取一枚二等銀牌，攢夠四枚二等銀牌又可以換取一枚五錢重的金牌。周樹人是這個班中惟一的一名獲得了金牌的學生。他得到金牌以後並不向別人炫耀，而是把它賣掉，將大部分錢寄給家裏，一小部分錢留下來買書用了。他知道家裏現在已經很困難，不可能接濟他學習費用，學堂每月發給的津貼不夠用，在礦路學堂讀書期間的生活隻能靠自己節儉了。冬天，學堂發放的棉衣薄得不足以禦寒，他就多吃辣椒來增加體內熱量，結果竟然養成了吃辣椒的習慣。
周樹人處處注意節省，每次回家都是自己扛行李，不像別的學生那樣找挑夫。在船上，當地的地痞無賴常常在開船前搶占船倉裏睡覺的地方，然後賣給乘客收取“臥鋪費”。大多數乘客都害怕這些地痞無賴，隻好花錢買他們強占的鋪位。但是，周樹人偏偏不吃他們那一套，從來不花錢買他們的鋪位，他把自己的行李往那兒一放，坐在行李上麵眼睛微閉，任憑那些地痞無賴怎麼樣威嚇就是不予理睬，如此對峙到要開船的時候，那些並不乘船的地痞無賴隻好乖乖地滾蛋。於是，被那些地痞無賴搶占的地方空出來了，周樹人從容地打開行李鋪好便舒舒服服地一直睡到紹興。在與地痞無賴的鬥爭中，他認識了社會惡勢力的外強中幹本性，一切惡勢力並不可怕，必須和他們進行針鋒相對的鬥爭。
礦路學堂的總辦是由陸師學堂總辦兼職的。當初陸師總辦是錢德培，據說是紹興“錢店官”出身，懂得德語，陸師學堂是按照德國體製辦的，聘請的都是德國教官，所以這位總辦就有用武之地了。後任的總辦是俞明震（字恪士），雖然也是候補道，卻是新派人士，是一位很開通的人。他思想活躍，每天坐在馬車上還閱讀維新派報紙《時務報》，給學生出國文題再也不是論管仲或漢高祖之類，而是出了一道《華盛頓論》，結果連國文教師都弄不明白，還要問學生華盛頓是個什麼人。周樹人對他一直很有敬意，在日記中說及這位總辦時稱他為“俞師”。
在總辦俞明震的倡導下，學堂裏設立了閱報處，不但有總辦喜歡的《時務報》，還有傳播國外新說的《譯學彙編》。周樹人每天都到這裏來閱讀。
周樹人在南京修業期間，所得到的提高確實不小。文史方麵知識底子是在家裏就打下的，而一般的自然科學知識則是在南京上學時學得的。此外加上一點《天演論》，便造成他的唯物思想的基礎。
一次，周樹人從南京城南書店買到一本《天演論》，使他愛不釋手，讀得著了迷。這本《天演論》是維新派嚴複根據英國人赫胥黎的著作《進化論與倫理學》翻譯過來的。嚴複針對舊中國貧窮落後的狀況，借著“物競天擇”、“優勝劣敗”的進化學說，在書中闡述了自己的觀點。他認為，在這個競爭激烈的世界上，中華民族不思進取圖強，就要受帝國主義列強的欺侮，總有一天在這個星球上將無法生存下去。書中充滿著激情，嚴謹的說理，優美的文筆，流暢的語言，使周樹人深深地被打動了，從中吸取了進化論的思想，激發了他學習西方先進科學知識的熱情。此後，嚴複的新譯作一出版，他就買來閱讀。他閱讀了甄克斯的《社會通論》、斯賓塞的《群學肄言》、孟德斯鳩的《法意》及《穆勒名學部甲》等著作，從此，周樹人開始如饑似渴地大量閱讀西方譯著。