為了證明這種現象，巴甫洛夫和助手們做了兩個有趣的試驗：
在每次給狗吃食物之前，都用燈光把狗照射一下，經過幾十次的照射，即使不給狗吃東西，狗見到燈光也流口水了。
接著，巴甫洛夫做了第二個試驗。狗喜歡啃骨頭，見到骨頭，就會去搶，或者饞得流口水。但是，巴甫洛夫拿來骨頭，每次隻讓狗見一下，而不讓它吃。結果，時間一長，狗不僅沒有唾液，不再流口水，反而隻用鼻子聞聞，就走開了。
經過這兩次試驗，巴甫洛夫把這樣一種反射現象稱做“條件反射”現象。就是說，在給狗提供了一定的條件和環境後，狗就會產生一種新的反射現象。那麼，這種條件反射原因是什麼呢？巴甫洛夫經過反複研究，認為這是由狗的大腦兩半球皮層引起的。它像一架靈敏度極高的儀器，通過連接身體各個部位的神經，把這些部位受到外界刺激的信號收集到一起，進行分析，就會引起反射了。
為了證明這一結論是否正確，巴甫洛夫把一隻狗的大腦皮層（灰質）切除，保留神經中樞的其餘部分。結果出現了這樣一個現象：
這隻狗仍然會走路，會吃東西，還能生育。總之，屬於天生的、非條件反射的行為都存在。可是，它卻不認識主人，嚇唬它也不逃走，食物放在它麵前不曉得主動去吃，隻有放到它嘴裏，它才會吃。
經過這一試驗，巴甫洛夫終於找到了引起條件反射的根源，由此，創立了它的新學說——“條件反射學說”。
巴甫洛夫在70多歲高齡時，仍然不辭辛勞，給自己提出了新的研究課題：在以往研究動物條件反射的基礎上，開始研究人腦的活動。
巴甫洛夫在對人的大腦活動的研究中，取得了重大成果。著名的“神經類型和兩個信號係統”的學說，就是他根據這項研究提出來的。
晚年，巴甫洛夫的腿開始浮腫。謝拉菲瑪警覺起來，要求他注意保重身體。
禍不單行，巴甫洛夫患上了流感。原本是會治好的，可是，一天他坐車回家時，車子突然壞掉了。因為已離家不遠，巴甫洛夫就沒有聽司機的勸阻，冒著風雪，徒步回到家裏。盡管巴甫洛夫身體一向很好，但畢竟已是八十多歲的老人。這次回家之後，病情便立時加重了。
謝拉菲瑪知道流感並不是大病，但這次她有種不祥的預感，以往巴甫洛夫不管患什麼樣的病，總是精神飽滿的樣子；而這次，巴甫洛夫總說自己渾身無力。昏昏欲睡，這是幾十年來不曾遇到的情形。
其實，巴甫洛夫早已注意到自己身體的變化，他在最近重病後，給朋友寫的一封信中，有這麼一段話：
“可詛咒的流感！可以說完全扼殺了我活到100歲的信心，直到現在我還留著一個病根。雖然到現在為止，我沒有改變我的工作安排和規模。”謝拉菲瑪寸步不離地呆在他身邊。在他去世前一刻鍾的時候，她抓住他的手，輕聲地說：“伊萬，握著我的手。”他竟握得那樣緊，把她的手都握痛了。
清晨，列寧格勒居民一走上大街，就看見全城都在下半旗致哀，四周靜悄悄的，廣播員正在通過無線電向全世界通告這位偉大的生理學家逝世的噩耗。
安放巴甫洛夫遺體的棺材置放在道利達宮。
瞻仰巴甫洛夫遺容的人流沒有盡頭，其中有科學家、學生、工人、作家、職員、紅軍戰士、中小學生。