作為地方土司，馬千乘以三千石柱兵從征，跟隨明朝四川總督李化龍討伐叛軍。秦良玉為解國難，又統精卒五百人，自備軍糧馬匹，與副將周國柱一起在鄧坎（今貴州鳳崗）扼守險地，持弓援劍殺賊。為此，明朝總督李化龍大為歎異，命人打造一麵銀牌贈與時年26歲的秦姑娘，上鐫“女中丈夫”四個大字，以示表彰。
萬曆二十八年（1600年）正月初二，明軍由於連連克捷，上下鬆懈，置酒高會，慶祝新春佳節。洞曉古今兵法的秦良玉多智，她預料賊軍會乘夜偷營，誡囑丈夫馬千乘命令“白杆軍”嚴禁飲酒，持矛裹甲，連夜分守險隘。半夜時分，明軍官兵大部分醉醺醺的沉入夢鄉，賊軍果然突然發動襲擊。醉夢中的官軍一時間四一奔逃。所幸的是，早有準備的秦良玉夫婦所領“白杆兵”發起反突襲，叛軍先勝後敗，惶駭間被長矛捅倒無數，皆轉身奔逃。
秦良玉夫婦緊追不舍，追入賊境，連破金築寨、明月關寨等七寨，直抵楊應龍叛軍老巢的天險桑木關下。
明軍諸軍喘息後集結，齊攻桑木關。由於山險關峻，甲胄衰身的明朝官兵一時束手無策。“白杆兵”此時頓顯神威，這些士兵的攀援能力本來就高超，又有特別矛鉤擁搭連，使得他們在短時間內演雜技一樣互相搭持攀掛，與酋陽土司等地方兵配合，一舉蕩破險關。關口拿下，明朝官軍奪門而入。
於是，眾人合兵，直搗海龍囤，殺得賊兵血流成河。賊首楊應龍駭然無奈，慌亂中自縊身死，插州之亂平息。
此次平亂，秦良玉、馬千乘夫婦“為南川路戰功第一”，為諸司之先，並又獲朝廷銀牌及色緞等物作為獎勵。
大功如此，秦良玉並未沾沾自喜，從不言功，夫婦二人仍回石柱本份過活。
十多年後，萬曆四十一年（1613年），秦良玉丈夫馬千乘死於政府獄中。《明史》記載說，石柱部民狀告馬千乘，明廷把他逮入雲陽獄，不久馬千乘病死其中。但他真正的死因，其實是北京萬曆帝派來的監稅太監丘乘雲向石柱索取賄賂，馬千乘自恃於朝廷有功，不予。這下可羞惱了丘公公，他指使手下捏造罪名，把馬土司逮捕入獄，活活折磨而死，時年僅四十一歲。
一下子變成孤兒寡母，秦良玉含淚忍痛。她大義為重，殯斂丈夫後，未有生出任何反叛不臣之心，反而代替丈夫任石柱土司，忠於職守。《明史》中這樣讚詡秦良玉：“（其）為人饒膽智，善騎射，兼通詞翰，儀度嫻雅。而馭下嚴峻，每行軍發令，戎伍肅然。”
萬曆四十四年（1616年），女真酋長努爾哈赤在赫圖阿拉（今遼寧新賓縣）建立“大金（後金）”，開始連連發動對明朝的進攻。兩年後，薩爾滸一役（戰場在今遼寧撫順以東），明軍慘敗，諸營皆潰。自此之後，駐遼明軍幾乎是聞警即逃。
東北告急，在此大背景下，明廷在全國範圍內征精兵援遼。秦良玉聞調，立派其兄秦邦屏與其弟秦民屏率數千精兵先行，她自己籌馬集糧，保障後勤供應。為此，明廷授秦良玉三品官服。
沈陽之戰中，秦氏兄弟率“白杆兵”率先渡過渾河，血戰滿洲兵，大戰中殺辮子兵數千人，終於讓一直戰無不勝的八旗軍知曉明軍中還有這樣勇悍的士兵，並長久為之膽寒。由於眾寡懸殊，秦邦屏力戰死於陣中，秦民屏浴血突圍而出，兩千多白杆兵戰死。但也正是由此開始，秦良玉手下的石柱“白杆兵”名聞天下。
得知兄長犧牲消息後，秦良玉製一千多件冬衣，配送給遠在遼地的石柱兵。然後，她自統三千精兵，直抵榆關布防（今山海關），控扼滿州兵入關咽喉。明廷兵部尚書張鶴鳴為此專門上奏天啟帝，追贈死難的秦邦屏都督僉事，立祠祭祀。不久，明廷又詔加秦良玉二品官服，封誥褒獎。
由於“白杆兵”戰鬥力強，明廷再下令征兵兩千。秦良玉聞詔即行，與弟弟秦民屏馳還石柱，征調士兵準備援遼。
抵家僅一日，重慶內亂。永寧土司奢崇明借奉詔援遼的名義，率數萬人馬與其女婿樊龍裏應外合占據了重慶，並發兵圍攻成都，大有關門做皇帝的意思。由於同為“土司”鄉親，奢崇明派人攜大筆珍寶來石柱與秦良玉“通好”。秦良玉二話不說，立斬賊使。她派遣秦邦屏及其二子溯流西上，度渝城後，忽然抵至重慶南坪關，扼製賊兵歸路。趁天黑敵軍無備，“白杆兵”突襲賊軍駐於長江和嘉陵江上的水軍，盡焚其舟。同時，秦良玉分兵守忠州，馳報夔州官軍密防瞿塘天險，阻遇叛軍沿江東下。