一、實驗目的
（1）學習掌握常見工業微生物菌種的分離篩選技術。（2）學習掌握選擇性培養基的設計與製備使用。
二、實驗原理
利用微生物生命活動的不同，以及它們對環境的響應，可對微生物菌種進行分離篩選。目前所采取的主要是富集培養與選擇性抑製培養。富集培養就是在特定的與所需要富集的微生物菌種性質相應的條件下，使目標微生物快速生長，而達到富集培養分離篩選的目的。選擇性抑製培養主要是采用相應藥物或試劑對非目標菌的生長進行抑製，使目標菌迅速成為優勢菌，有利於達到分離篩選的目的。根據分離目標菌的不同，通常采用不同的藥物。土壤是微生物的大本營，因此土壤樣品通常成為分離微生物菌種的主要來源。此外，對於生產性狀衰退的生產菌種，從中選優也是菌種分離篩選的重要來源。
三、實驗器材
（一）樣品醋醪樣品、已退化的灰色鏈黴菌斜麵。
（二）培養基（1）米曲汁碳酸鈣乙醇培養基：米曲汁（10°Brix）100mL，CaCl21克，95％乙醇3～4mL，pH自然。配製時不加入乙醇，滅菌後使用前加入。（2）葡萄糖天冬素培養基。（三）玻璃器皿若幹略。
四、實驗步驟
（一）醋酸菌的分離篩選1.富集培養取醋醪樣品接種於米曲汁硫酸鈣乙醇液體培養基中（加入3%～5％乙醇），30℃振蕩培養過夜。鏡檢且有醋味即可作平板分離。2.平板塗布分離（1）采用10倍稀釋法對上述培養物進行適當稀釋後，用移液器吸取01mL至無菌的米曲汁碳酸鈣乙醇固體培養基中（製備平板前臨時加入乙醇），采用無菌塗布棒在平板表麵塗布，連續塗5塊平板。30℃培養3～5d。（2）觀察並記錄菌落的出現及其周圍透明圈的有無和大小。（3）挑取透明圈大的單菌落，采用劃線分離的方法再接種於米曲汁碳酸鈣乙醇固體培養基平板，30℃培養3～5d。（4）挑取透明圈大的單菌落，接種於米曲汁碳酸鈣乙醇固體培養基斜麵，30℃培養3d。革蘭氏染色、形態觀察，4℃冰箱保存。3.醋酸菌進一步分離鑒定可采用16SrRNA測序等方法對醋酸菌進行鑒定。分離篩選流程圖如圖17\|1所示。圖17\|1分離篩選流程
（二）灰色鏈黴菌的分離篩選1.活化菌種：將原始菌種轉接到培養基平板，於28℃恒溫培養，培養3～5d後將孢子轉接至試管斜麵，28℃恒溫培養3d。2.孢子懸浮液製備：10mL無菌水將斜麵孢子懸浮，取1mL懸浮液至裝有50mL無菌水的300mL三角瓶中（帶適量玻璃珠），振蕩分散均勻，無菌過濾，得孢子懸浮液。3.計數並稀釋：采用血球計數法測定孢子濃度，10倍稀釋法適當稀釋後取01mL塗布葡萄糖天冬素培養基，28℃倒置培養5～7d。4.挑取單菌落：根據高活力菌種的形態特征，一般挑取菌落比較大、氣生菌絲粗壯、孢子茂盛、色澤正常的單菌落至斜麵培養保存。5.鏡檢：有無雜菌，並進一步測定其效價。
五、實驗記錄
（1）菌種在平板上的生長狀況及菌落周圍透明圈的大小。（2）鏡檢結果。（3）灰色鏈黴菌的形態特征圖示，尤其是孢子絲。（4）退化菌種與優良菌種的比較。
六、思考題
（1）在分離篩選培養過程中若添加適當濃度的醋酸，對分離結果有何影響？（2）碳酸鈣的作用是什麼？（3）退化菌種的選優過程中，如何提高選優的效率？（4）菌種退化的主要原因有哪些？
參考文獻
［1］杜連祥.工業微生物學實驗技術［M］.天津：天津科學技術出版社，1992.