籠罩在信長和家康頭頂的烏雲，瞬間一掃而空。長舒一口氣的織田信長，下定決心要以最快的速度解決畿內諸般問題。然而可憐的足利義昭將軍卻並沒有及時得到武田退兵的消息，他受三方原大勝的鼓舞，決定要和信長正式翻臉了。
室町幕府的滅亡
從永祿十一年（1568年）織田信長擁足利義昭進京開始，畿內政權就具有奇特的兩重性，任何分封領土等重要文件，都會蓋上義昭的“禦下行”和信長的“禦朱印”兩方印章。然而實際上，前一方印章是空頭的，後一方才具備實際效力。
況且，雙方合作的蜜月期維持時間並不長，很快就因為義昭的輕舉妄動，信長開始頒發文件來約束其權力。1570年擬定的《五條書》，主要內容即為——
一，凡將軍頒發之重要文件，均需有信長副署才產生效力；二，以前將軍頒發之詔令全部無效；三，對屬下的恩賞，悉委托信長處理；四，天下政務，信長可不經過將軍自行處理；五，天下平定後，一切禮儀規章，皆由將軍施行。
信長的意思很清楚，平定亂世不能依靠喪失權柄已久的室町幕府，而必須依靠自己的岐阜政權，類似於“戰時獨裁政府”，要等四海澄清，他才會把權力交還給義昭將軍——當然，到了那個時候，誰都不相信他真會乖乖交權的。
同時，信長還扛出空殼的天皇朝廷來製約和分流幕府的影響力，他修繕皇宮，貢獻金銀，裝出一副對朝廷極端恭順的態度。這是為了告訴天下人，真正有資格統治日本的並不僅僅是幕府將軍，還有京都的天皇，幕府隻是朝廷的一個執行機構，天下實權並非有史以來就掌控在幕府手中，當然更不會延續萬年，一直握在室町將軍手裏。
在這種情況下，足利義昭本人的處境比當年仰三好氏鼻息的兄長足利義輝好不了多少，他當然無法忍受，而要嚐試暗中反抗了。得知武田信玄離開甲斐，揮兵上洛的消息以後，義昭立刻磨刀霍霍，準備公開與信長決裂。
信長的目光一直盯在畿內，從未離開過二條城的傀儡將軍，在洞悉了足利義昭的圖謀後，他派日乘上人、島田秀滿和村井貞勝三人前往覲見義昭，要求他交出人質，並簽署絕不刀兵相向的誓書。沒能看清形勢的義昭當然不肯乖乖就範。
次年是元龜四年，也是天正元年（1573年），二月，在義昭的唆使下，近江豪族山岡光淨院景友、磯貝新右衛門等人糾集領地附近的一向一揆，在今堅田築砦謀叛。信長急派柴田勝家、明智光秀、丹羽長秀、蜂屋賴隆四將率軍征伐，水陸並進，於二十九日將叛亂鎮壓。幾乎就在同時，京都附近出現了一首童謠：“應思父母養育恩，忍看暴雨摧落花”——“花”意為“花之禦所”，代指幕府將軍，這首童謠正是義昭不滿信長專權的真實寫照。
三月二十五日，得到武田軍請和消息的信長離開岐阜，統率大軍再度上洛。當他來到逢阪地方的時候，義昭的直屬家臣細川藤孝和荒木信濃守村重前來會和，以向信長證明自己的忠心，信長即賞賜藤孝名品脅差，賞賜村重“鄉義弘”的太刀。四月三日，信長進入京都，包圍了二條城，足利義昭這才慌了手腳，急忙請朝廷出麵調解，在保證絕不再敢悖逆信長旨意，同時雙方交換誓書後，織田軍暫時退兵。
信長當然知道義昭並非真心降伏，稍有風吹草動，這個惟恐天下不亂的家夥又會再冒出頭來，但他不能不給朝廷一個麵子，更不能不給自己塗抹更濃重的“無可奈何才以下犯上”的油彩。離開京都以後，他行軍遲緩，不肯即歸岐阜，四月七日來到守山，轉頭攻擊鯰江城的老對手六角義賢之子右衛門督義治。因為據說附近的百濟寺（在今滋賀縣多賀町附近）暗中支持鯰江城，信長大怒，反正他燒佛寺也不是頭一回了，於是在四月十一日放一把大火，將百濟寺夷為平地。
留下佐久間信盛、蒲生賢秀、丹羽長秀、柴田勝家四將繼續攻擊鯰江城，信長繼續緩緩地東歸。五月二十二日，他進入佐和山城，隨即命令在此地建造巨大的戰船。這些船長達七十米，寬十多米，有搖櫓百具，箭樓無數——七月五日，戰船建造完工，但前此誰也不知道信長要拿它來做些什麼。
七月三日，以為信長已經回歸岐阜，短時間內無法再上京都的足利義昭，果然又耐不住性子了。他命令伊勢貞興、三淵藤英守備二條城，還扛出朝廷公卿中納言日野輝資、參議高倉永相等人坐鎮，自己則潛往槙島城，憑堅固守。消息很快報到佐和山，於是信長就在大戰船完工的翌日，乘風破浪橫渡琵琶湖，於七月九日以迅雷不及掩耳之勢攻入二條城。義昭本來擺兩尊公卿“菩薩”在二條，是想使信長投鼠忌器，不敢玩硬的，沒想到織田大軍一到，這兩位公卿先自慌了，主動開城出降。
大軍製壓二條，立刻轉往槙島城。橫在城前是洶湧的宇治川水，信長命令渡河作戰，諸將卻都逡巡不敢冒進。信長大怒，一馬當先衝下水去，於是大軍得渡，神速地攻克槙島城，捉住了足利義昭。
參加此役的有許多年輕人，後來都成為織田政權下赫赫有名的戰將，包括：稻葉一鐵子稻葉貞通、氏家卜全子氏家直通、不破光治子不破直光、丸毛長照子丸毛兼利、細川藤孝子細川忠興、蒲生賢秀子蒲生氏鄉、山岡景隆子山岡景宗，以及京極高次等等。
戰後，信長把足利義昭年僅兩歲的兒子捉來當了人質，而把義昭流放到河內國若江城，派羽柴秀吉嚴密看護。就這樣，室町幕府滅亡了，信長真正迎來了自己的嶄新時代！
殘敵殄滅
織田信長此次攻入京都二條城，來勢凶猛，並且為了威逼二條開城投降，放火焚燒了附近部分民居，引起京都百姓的恐慌。在京都所司代村井貞勝的請求下，他攻克槙島後就立刻回歸京都，處理政事。同時，他派諸將逐一掃平畿內響應足利義昭的各勢力：比睿山麓一乘寺的渡邊宮內少輔、磯貝新右衛門，近江高島郡的木戶、田中兩砦，以及澱城的岩城友通、番頭大炊助、諏訪飛驒守三將。八月四日，信長回歸岐阜。
但是他回到老家，屁股還沒坐穩，就得到了江北豪族阿閉淡路守貞征密約投誠的消息。如此大好良機怎可錯過？信長立刻於八月八日離開岐阜，會合畿內諸將，準備一舉消滅淺井、朝倉這兩頭臥榻旁狂吠不休的猛犬。
織田軍首先攻克月瀨城，然後一邊監視小穀城的動向，一邊繞路行至大嶽以北的山田山，意圖截斷淺井與朝倉兩軍的聯係。匆匆從越前趕來增援的朝倉義景近兩萬人馬因此無法靠近小穀城，隻得在邊境線上的餘吳、木之本、田部山等地布陣。八月十二日夜晚，風雨大作，信長命長男織田信忠留守在虎禦前山的本陣，自己則親自統率馬迴眾，冒著暴雨仰攻大嶽。
經過激戰，大嶽大築城、丁野山丁野城先後降伏，至此朝倉方與小穀城徹底失去聯係。朝倉軍士氣低落，被迫向越前方向退卻。十三日夜，信長要先鋒佐久間信盛、柴田勝家、瀧川一益、蜂屋賴隆、丹羽長秀、羽柴秀吉、稻葉一鐵等將火速追擊殘敵，勿使一人逃脫，然而諸將卻行動遲緩，幾乎貽誤戰機。信長大怒，喝罵道：“如此懈怠，定有隱情。你們莫非心懷二意嗎？！”
柴田、瀧川等將在信長的喝罵下，低頭不敢申辯，佐久間信盛卻眼含淚光說道：“您可以責怪我們無用，怎能懷疑我們的忠誠呢？”信長更為暴怒，斥責道：“你這家夥仗著資格老，竟敢自高自大地頂撞於我！”據說他從此就開始極端厭惡這個世代老臣。
信長親自領兵追趕朝倉軍，根據情報分析，朝倉兵馬分為兩路，一路從中野河內口，另一路從刀根山口，淩亂地向越前國退卻。經過諸將會商，一致認定：“敵軍主力，應該依賴敦賀方麵的支城向國內退卻，因此必走刀根山一線，通往疋田。”