但是，由於桂王政權內部的不團結，1649年，湖南就被清軍占領，何騰蛟在湘潭被俘就義；瞿式耜也在桂林城失守後被清軍殺害。在桂王政權麵臨覆滅的時刻，李定國領導的大西農民軍，擔負起抗清的重任，在西南一帶又繼續戰鬥了十多年。
李定國是陝西延安人，十歲參加農民軍，機靈勇敢，被張獻忠收為養子，成人後，驍勇善戰，被稱為“萬人敵”。張獻忠建立大西國，封李定國為平西將軍。
張獻忠的養子還有孫可望、劉文秀、艾能奇，都受封為將軍。張獻忠犧牲以後，留下五六萬起義軍由孫可望、李定國率領，南下貴州、雲南，他們派人向永曆帝建議，要求一起抗清。經過一番周折，永曆帝看到形勢危急，隻好依靠大西軍，封孫可望為秦王。
孫可望是個野心家，他忌妒李定國的名望，處處找機會打擊他。李定國始終以團結對敵的大局為重，盡量忍讓。
孫可望把永曆帝接到貴州，卻把聯合抗清的大臣拋到腦後，隻想著牢牢控製住永曆帝，實現他割據西南、獨霸一方的野心。這時，李定國卻在雲南花了兩年時間，訓練了三萬精兵，製造了一批武器盔甲；他還找了一批馴象的人，組成一支象隊。在做好準備之後，決定出兵進攻清軍。
1652年，李定國開始對清軍發起進攻，北路軍攻四川，李定國自帶的東路軍攻湖南。行前，李定國申明軍紀：不殺人，不放火，不奸淫，不殺耕牛，不搶財物。他的軍隊作戰勇敢，紀律嚴明，受到百姓歡迎，打了不少勝仗。
打下湖南沅州（今湖南芷江）和靖州（今湖南邵陽）後，李定國偵察到桂林的清軍防守空虛，決定分三路進攻桂林。後來因情況變化，他當機立斷，集中兵力，突襲桂林。駐守在桂林的清軍主帥孔有德派兵迎戰，還沒接觸農民軍，就被農民軍的氣勢給嚇得紛紛潰逃。孔有德不得不親自帶兵到嚴關，和明軍對壘。李定國大軍一到，前麵是高大的象隊，後麵是雄赳赳的兵士。大象一上陣吼叫起來，清軍戰馬聽到大象的吼聲，嚇得亂蹦亂跑。那時，天忽然下起大雨，電閃雷鳴，象群趁勢一衝，清兵大敗，明軍奮勇追擊，殺得清軍一敗塗地。
孔有德急忙把兵士撤進桂林城，把城門關住。李定國率軍跟蹤追到城門外，日夜不停地圍攻，孔有德親上城頭指揮，明軍的亂箭射去，正中孔有德的前額。這時候，他又得到城北山頭已被李定國攻占的消息，他徹底絕望了，便跳進熊熊烈火中自焚而死。
李定國一鼓作氣，又攻克柳州、梧州、衡陽、長沙，永曆帝得到捷報，封李定國為西寧王。而清廷得到消息後，則大受震動，連忙派親王尼堪帶兵十萬反攻長沙。李定國為避開清軍銳氣，主動從長沙撤出，卻在退到衡阻的路上設下伏兵。尼堪親自率兵追擊，中了明軍的埋伏，尼堪當場被砍死了。
孫可望對李定國的勝利十分忌妒，他邀請李定國去沅州議事，企圖陷害他。幸好有人密報，李定國才沒遭毒手。為避免衝突，李定國南下兩廣。但他在兩廣的作戰並不順利。與此同時，孫可望調派他的軍隊到湖南進攻清軍，想搶個大功，卻遭到大敗，連李定國光複的許多城市都丟了。
李定國始終希望與孫可望和解，共同抗清。公元1657年，他派人去貴陽講和，還將孫可望的家屬送去。但孫可望依仗兵力眾多，直接向李定國發起進攻。可是，他手下的將士們恨透了他的分裂活動，在雙方交戰的時候，紛紛倒戈奔向李定國一邊，孫可望隻帶著二十幾個親信，逃到長沙，投降了清軍。
孫可望的投降，使南明政權的力量大為削弱。第二年，清兵由降將吳三桂、洪承疇等率領，分三路進攻雲南、貴州。李定國分三路阻擊，都遭到失敗，不得不退回昆明。永曆帝和他的幾個親信官員驚慌失措，逃往緬甸。
李定國繼續在雲南邊境上招兵買馬，準備積蓄力量，打擊清軍。為了穩定軍心，李定國接連十三次派人去接永曆帝回國，永曆帝卻不敢回來。
公元1661年12月，吳三桂帶領十萬清兵開進緬甸，逼迫緬甸交出永曆帝，帶回昆明。一到昆明，永曆帝被吳三桂勒死，最後一個南明政權到這時候徹底滅亡。
公元1662年農曆六月，李定國病重，在雲南猛臘逝世。臨終前，他對眾人叮囑說：“寧可死在荒野，也不能投降清軍！”