1499年，達·芬奇離開米蘭，並於1500年4月回到家鄉佛羅倫薩，在此逗留了5年。期間，他創作了舉世聞名的肖像畫《蒙娜麗莎》。在這幅畫中，達·芬奇一掃中世紀肖像畫中人物那種生硬、呆板、缺乏內在感情的形象，敏銳地抓住了蒙娜麗莎在微笑的一瞬間迷人的表情，刻畫了一個溫柔典雅、對生活充滿著信心和喜悅情感的市民階層婦女的典型形象。《蒙娜麗莎》標誌著達·芬奇繪畫藝術的最高成就。
1502年，達·芬奇開始擔任一項工程的總工程師，在這一活動中，達·芬奇勾畫了一些城市規劃草圖和地形圖，為近代製圖學奠定了基礎。1503年達·芬奇得到了一次寶貴的訂件，即為佛羅倫薩的韋基奧宮500人會議廳繪製一幅壁畫；這件描繪曆史故事場麵的作品比例尺寸巨大，其規模大概是《最後的晚餐》的兩倍。他在這件《安加利之戰》上花了三年時間；和原擬與之匹配的米開朗基羅的《卡希那之戰》一樣，這件壁畫作品也未最後完成。這件作品的草圖和複製品中所表現的是爭奪軍旗的主要戰鬥場麵；用雕塑家切利尼的話說，這些草圖長期以來一直是“世界的學校”。
這一時期也是達·芬奇集中精力投人科學研究的時期；他在新聖馬利亞醫院做過解剖實驗，並將其解剖學研究擴展為對人類器官的結構和功能作全麵的研究。他對鳥類的飛翔進行過係統的觀察，並準備為此撰寫一篇論文。甚至他對“水的本質和運動”進行的水文學研究也發展為對水的物質性（尤其是水流的規律）的研究，並且將之與空氣的物質屬性相比較。這些也都被他收入了自己的資料集中。
1506年5月，達·芬奇因政治原因接受了法蘭西國王在米蘭的總督的邀請來到了米蘭。達·芬奇在米蘭一住就是六年，由於受到雇主的賞識和禮遇，達·芬奇不辭辛勞地為其工作，完成行宮和一些工程的設計圖。在米蘭期間他極少作畫。他允諾法蘭西國王的兩幅聖母像始終沒有畫成。他繼續繪製從佛羅倫薩帶來的《聖母子與聖安娜》和《麗達》兩幅畫，這一事實可在當時倫巴第派的複製品中得到明證。達·芬奇身邊再一次聚集了不少弟子。1508年一件重要的雕塑訂件終於落到了他的身上。特裏武爾齊奧以法國軍隊元帥的身份勝利返回米蘭。他委托達·芬奇為他製作陵墓雕刻，打算采用騎馬像的形式安置於由特裏武爾齊奧捐獻給聖那紮羅大教堂的停屍間小教堂。但是經過對這項紀念工程的數年準備工作後（現仍存有當時為這一工程繪製的許多重要草圖），元帥本人放棄了原來的計劃而偏愛一個規模較小的方案，所以這項工程亦沒有最後完成。
1513年，因為一場政冶事件，年已60歲的達·芬奇再度遷徙。同年年底，來到羅馬。達·芬奇在這座“不朽城”一直待了三年，始終遭人冷落，此時拉斐爾在繪製教皇新寓所中的壁畫，米開朗基羅正全心完成尤利烏斯教皇的陵墓工程。大量飽含苦澀的手稿反映了這位年邁大師的失望心理，他仍埋頭於數學研究和技術實驗中。在如此孤寂的生活中，很容易理解達·芬奇為何不顧65歲高齡而決定接受年輕的國王弗蘭西斯一世的邀請去法國為他效命。
1516年末，達·芬奇永遠地告別了意大利，同行者是他最忠實的學生梅爾齊。他在盧克（後稱克洛一呂塞）的小寓所中度過了一生中最後的三年，這裏臨近盧瓦爾河，位於昂布瓦斯的國王的夏宮。“國王的首席畫師、建築師和機械師”是他的光榮頭銜，敬慕他的國王給他以完全的活動自由。他不再作其他的畫，頂多是在畫完那幅神秘莫測的《施洗聖約翰》；阿拉貢紅衣主教在訪問昂布瓦斯時曾在達·芬奇的畫室中見到過此畫以及《蒙娜麗莎》和《聖母子與聖安娜》。達·芬奇仍舊為宮廷節日做策劃設計，但國王處處對他待如貴賓。達·芬奇的大部分時間用於整理和輯錄其科學研究成果，論繪畫篇的終稿及解剖學研究的一部分得以問世。像《逍遙的人物》這樣完美無缺的素描作品最終證明了達·芬奇永不泯滅的天才。在所謂《世界的末日》或稱《大洪水》中，他以強烈的圖畫想像描繪了主宰自然的原始力量。1519年5月2日，這位偉大的藝術家溘然辭世，他被安葬在聖弗洛朗坦宮廷教堂。