7.篩孔
支持物瓊脂和聚丙烯酰胺凝膠都有大小不等的篩孔,在篩孔大的凝膠中溶質顆粒泳動速度快。反之,則泳動速度慢。
除上述影響泳動速度的因子外,溫度和儀器裝置等實驗條件也應考慮。
二、電泳的分類
電泳的種類繁多,但基本原理一致,按分離原理和有無支持物分別分類如下。
(一)按分離的原理分類
按分離的原理,可分為區帶電泳、移界電泳和穩態電泳。
1.區帶電泳
區帶電泳是指有支持介質的電泳,待分離物質在支持介質上分離成若幹區帶。支持介質的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散,以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區帶電泳由於采用的介質不同以及技術上的差異,又可分為不同的類型。根據其所用支持物的性質,大體可分為兩類:一類是僅起支持和抗擴散、抗對流作用的物料,比如濾紙、纖維素及其衍生物(如醋酸纖維素、DEAE-纖維素等);另一類物料則是不僅起支持和抗擴散、抗對流作用,而且還具有分子篩功效,比如澱粉、瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠等。澱粉凝膠電泳多用於同工酶分析,凝膠鋪厚些,可一層一層剝層分析(一板多測)。天然澱粉經加工處理即可使用,但孔徑度可調性差,並且由於其批號之間的質量相差很大,很難得到重複的電泳結果,加之電泳時間長,操作麻煩,分辨率低,實驗室中已很少使用。瓊脂糖有一個相對較大的孔徑,用來分離大分子例如核酸、大蛋白和蛋白複合物。聚丙烯酰胺形成孔徑較小的膠,適合於分離大多數蛋白質和多肽。
2.移界電泳
膠體溶液的溶質顆粒經過電泳後,在膠體溶液和溶劑之間形成界麵的電泳過程。最簡單的移界電泳是在一U形管中裝入一定量的帶色膠體溶液,如黃色硫化砷膠體溶液或血紅蛋白溶液,然後小心地分別在此管兩端注入等量的稀電解質溶液(NaCl溶液或一定pH的緩衝液),使其與膠體溶液之間有明顯的界麵。接著在該管兩端插入鉑電極,通直流電,過一段時間即可看到一邊膠體溶液的界麵上升,另一邊則下降,這是膠體顆粒產生泳動的結果。移界電泳法具有重要的曆史意義,它的成功在於巧妙地解決了幾個問題:能形成清晰的起始界麵;靠密度梯度能夠穩定界麵;能良好地散熱;在泳動過程中可用光學方法顯示其組分。但為了得到清晰的界麵,以及使界麵移動能用光學係統反映出來,通常需要一套複雜的電泳儀裝置,這就使移界電泳的廣泛應用受到了限製。
3.穩態電泳
樣品分子的電泳遷移在一定時間後達到一個穩態,包括等電聚焦和等速電泳。等電聚焦即由多種具有不同等電點的載體兩性電解質在電場中自動形成pH梯度,被分離物質則各自移動到其等電點而聚成很窄的區帶,該方法分辨率很高。等速電泳即在電泳達到平衡後,各區帶相隨,分成清晰的界麵,以等速運動。
(二)按有無固體支持物分類
根據電泳在溶液中進行還是在固體支持物上進行,又可分為自由電泳和支持物電泳兩大類。
1.自由界麵電泳
又稱移動界麵電泳,是指在沒有支持介質的溶液中進行的電泳,包括等速電泳、柱電泳、顯微鏡電泳等。因為其電泳儀構造複雜、體積龐大、操作要求嚴格、價格昂貴等,自由界麵電泳的發展並不迅速。
2.支持物電泳
即區帶電泳,待分離物質在支持介質上分離成若幹區帶。這是應用最多的電泳形式。
作為一種分析工具,電泳簡單、快速,並且具有高靈敏度。此方法主要用來研究單一、帶電荷的分子的特性,也用來作為一種分離技術。本章將著重討論以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的凝膠電泳法的基本原理和具體操作。