19歲的袁世凱是中國駐高麗總督吳長慶手下一名小分統，馬相伯和吳長慶原有舊交，又是高麗政治顧問。袁世凱對比他大19歲的馬相伯十分恭敬：“馬顧問，有什麼捷徑可以飛黃騰達？”馬相伯便尋開心道：“隻有厚賂宦官，由宦官結納親貴，便可越級而升，做撫督也不難。”袁世凱信以為真，如法炮製，居然生效，幾天後見到馬相伯十分高興，他說：“您的辦法真靈光，你見事如此透澈，代我籌劃，又如此奇效。為什麼自己不這樣做呢？”馬相伯感到好笑：“我這個人隻會講，不會做，所以終生是窮書生嘛！”
有一次，袁世凱將一份重禮送給馬相伯，請馬相伯在吳總督處走走路子，提拔他。馬相伯辦事是一板一眼的人，連忙回絕：“這事萬萬通融不得，你對國事應多忠誠，做官忌心切。”“馬顧問不必當真，我是說說笑笑而已。”袁世凱厚著臉皮，笑吟吟地離開。馬相伯拿著手上的禮品：“這禮品你帶回去，我不能接受。”“馬顧問，這是我的一點小意思，不妨留著。”袁世凱急忙走了門外。馬相伯拎著禮品，喉嚨高了一倍：“你再不拿走，我就擲出門外。”
袁世凱無奈，隻好接回禮品，悻悻離開了，他就到吳長慶麵前挾嫌誣告：“吳總督，馬顧問這人，官儀不檢。”吳長慶皺著眉頭：“你怎麼能諂誣馬顧問。”“馬顧問在公署挾妓女飲酒睡覺。”“此話當真？”“是我手下人親眼所見。”吳長慶為人正派，生平最恨此事，就對袁世凱說：“本官自會處理，你先別聲張。”第二天清晨四點多鍾，吳長慶獨自一人，來到馬相伯的住處，直入臥室，看見馬相伯在榻上獨眠，沒見什麼妓女，也放下心來。馬相伯聽見聲響，見是吳長慶忙起身道：“吳總督起得這麼早，為什麼不事先通知一聲。”“沒什麼事，出來轉轉，你睡，你睡。”吳長慶含糊其辭地離開。
後來，馬相伯得知吳長慶因袁世凱打的小報告而來，一笑了之，也沒往心上去。當他回國述職時，袁世凱又再三纏著馬相伯說：“顧問大人，請在李中堂處為小弟多說幾句，舉薦一下。”馬相伯沒有計較袁世凱以前的誣告之事，說：“好吧，我盡力舉薦。”
馬相伯回國後，向李鴻章介紹了朝鮮的有關情況。“馬公，可有什麼合適的做朝鮮商務委員？”李鴻章詢問馬相伯便接口道：“袁世凱這人有點本事，對朝鮮情況也有點熟悉，李伯相，就派袁世凱擔任如何？”李鴻章一時也沒有適當人選，又是馬相伯的舉薦，就派袁世凱為清廷駐朝鮮的商務委員。可袁世凱做了駐朝商務委員，任意侮辱高麗君臣，這樣促使高麗傾向日本，而爆發了中日之戰。
袁世凱對馬相伯出於感恩和推崇，在1912年竊取中華民國臨時大總統職位後，禮聘馬相伯為最高顧問。馬相伯反對袁世凱改共和為帝製，一次，袁世凱和馬相伯閑談時問：“人民不知敬事長上，國家何以安？天下何以治？”馬相伯吃透他想當皇帝的心思，不緊不慢地說：“你所指的是一種磕頭請安才能表現出敬事長上嗎？如果這樣便能安邦定國，平治天下，那麼老夫願意從今天開始，朝叩一頭，晚多一拜，日日不懈，為天下倡。”袁世凱隻好尬尷地點點頭。
袁世凱命長子袁克定設宴邀請馬相伯和嚴複，征求意見。馬相伯坦率地說：“袁總統真要稱帝，也得不到國民的擁護，一定會遭到反對，就是這點暫不考慮，可是外交方麵，也會遭到強國藉口，百端要挾，以遂其大欲。這樣連鎖反應，勢必引起國內全體國民聲討，弄得不可收拾，以我看還是打消這種想法吧！”袁克定稱是。第二次設宴，袁克定欣然相告，外交已無問題，日本方麵表示讚成。馬相伯看已到了口舌所不能挽回的地步，便想辭官南下。
1915年7月，馬相伯任憲法起草委員會委員，袁世凱親自祭天祭孔，提倡“尊孔讀經”，袁氏黨徒在憲法中規定孔教為國教，為複辟帝製造輿論，馬相伯大加反對，著有《一國無首應兼主祭主事否》、《憲法草案大二毛子問答錄》、《保持約法上人民自由權》等文，並為各區教會代擬五篇請願書，以信仰自由為理由，駁斥尊孔教為國教和以“孔子之道為修身大本”的主張。
袁世凱不顧國人的反對，做了“中華帝國”皇帝。臨朝時，文武百官齊叩首，隻有馬相伯站立不拜。袁世凱沒辦法，隻好搬張椅子給馬相伯坐下。馬相伯為反對袁氏帝製，辭職準備南歸。但是袁世凱卻不放過他，在馬相伯住宅四周，都派密探。
馬相伯就在密探不注意時，化裝成一個買菜的老家人，帶了竹籃子隻身逃出了北京城，到上海住了下來。他發表《國民照心鏡》一文二萬餘言，痛斥袁世凱稱帝之罪，表達他主張共和政治的卓見。他對朋友說：“袁世凱把我戲謔之言，奉為做人的科律，而民國竟以此人為開國總統，國事又安可問耶？百複辟，百複亡。”袁世凱身敗名裂，一命嗚呼時，馬相伯歎道：“袁世凱對國事本無忠誠，做官心切，皆私字一念害之，當日我推薦他當駐朝鮮通商大臣，也不能不咎其咎。”