自由基(free radicals，FRs)是機體氧化反應中產生的有害化合物，具有強氧化性，可損害機體的組織和細胞，因而在生物體內具有重要的生理及病理功能，具有重要的生物學意義。由於自由基具有生物半衰期極短、化學反應性極強、極不穩定、在生物體內的濃度很低等特點，直接檢測非常困難。而尿囊素屬於咪唑雜環化合物，是尿酸的衍生物，尿酸作為一種抗氧化劑，和自由基作用後產生尿囊素。由於尿囊素性質穩定，能夠不受尿酸含量的影響準確反應機體內自由基水平，因此可以作為生物標記物，可替代對自由基的直接測定，評判機體氧化或抗氧化狀態。
（一）原理
樣品經離心去除固形物，再用合成尿液比例稀釋製成待測樣液，樣液經超高效液相色譜串聯質譜測定。內標法定量，方法的檢出限為0.06×10-12mol。（二）儀器與試劑
1.儀器
(1)超高效液相色譜（配有串聯四級杆質譜檢測器）；
(2)液體混勻器；
(3)離心機。
2.試劑
所用水均為去離子水或同等蒸餾水；所用試劑如不加說明均為分析純試劑。
(1)甲醇（色譜純）；
(2)乙腈（色譜純）；
(3)甲酸（色譜純）；
(4)合成尿液；
(5)配製尿囊素標準溶液：稱取適量標準品用合成尿液配製成500μmol/L的儲備液；
(6)DL-Allantoin-5-13C；1-15N標準溶液（內標）：稱取適量標準品用合成尿液配製成100μmol/L的儲備液；
(7)質控樣品：實驗室自行製備。
（三）測定方法
1.樣品的製備
尿液樣品應經過15000r/min離心10min去除固形物。取25μL尿液樣品（或者質控樣品、標準樣品），加入25μL 100μmol/L 內標溶液（DL-allantoin-5-13C；1-15N），在液體混勻器上混勻60s後，再加入含有0.5%甲酸的乙腈水溶液（95∶5，體積比）450μL，渦旋混勻60s。將樣液於15000r/min離心10min，取上清液，用超高效液相色譜串聯質譜分析。
2.色譜條件
(1)色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC柱（1.7μm，100mm×2.1mm）或相當者；
(2)流動相：含有0.5%甲酸的乙腈-水溶液(95∶5，體積比)；
(3)流速：200μL /min；
(4)柱溫：40℃；
(5)進樣量：5μL。
3.質譜條件
（1）多反應監測：尿囊素159.1→116，內標物161.1→118；
（2）去溶劑溫度：350℃；
（3）毛細管電壓：3.5kV；
（4）錐電壓：19V；
（5）碰撞能量：8eV；
（6）碰撞氣體（氬氣）：0.13Pa；
（7）分析時間：4min。
4.測定
準確吸取標準物溶液和樣品提取液各5μL分別注入色譜係統，以標準物的保留時間與多反應監測離子對定性，通過內標方法計算尿囊素的含量。
（四）結果計算
參考文獻
Adviye A.Tolun，Haoyue Zhang，Dora Il’yasova，et al..Millington Allantoin in human urine quantified by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.Analytical Biochemistry，2010（402）:191～193.