青蒿素是從中藥青蒿中提取的有過氧基團的倍半萜內酯藥物,毒性低,使用安全,是一種有效的抗瘧疾物質。主要用於間日瘧、惡性瘧的症狀控製,以及耐氯喹蟲株的治療,也可用於治療凶險型惡性瘧,如腦型、黃疸型等。
(一)原理
血清樣品經乙腈沉澱蛋白,離心後,將有機相過濾,經超高效液相色譜串聯質譜測定。內標法定量,方法的定量檢出限(LLOQ)為4ng/mL。
(二)儀器與試劑
1.儀器
(1)超高效液相色譜(配有串聯四級杆質譜檢測器);
(2)液體混勻器;
(3)離心機。
2.試劑
本實驗用水均為去離子水或同等蒸餾水;所用試劑如不加說明均為分析純試劑。
(1)甲醇(色譜純);
(2)乙腈(色譜純);
(3)甲酸;
(4)配製青蒿素血清標準溶液:稱取適量青蒿素標準品用甲醇配製成1mg/mL的標準儲備液,使用前取50μL標準儲備液加入5mL空白大鼠血清中,製得濃度10000ng/mL青蒿素血清標準溶液,使用前用空白血清稀釋至合適濃度;
(5)配製β-青蒿乙醚標準溶液(內標):稱取適量標準品用甲醇配製成20μg/mL的標準儲備液。
(三)測定方法
1.樣品的製備
取100μL含有青蒿素的血清樣品到Eppendorf微管中,加入50μL內標溶液(20ng/mL),然後加入300μL乙腈沉澱蛋白質。微管在液體混勻器上旋渦5min,10000r/min離心20min,取上層有機相,經濾膜過濾後,用超高效液相色譜串聯質譜分析。
2.色譜條件
(1)色譜柱:ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(1.7μm,50mm×2.1mm)或相當者;
(2)流動相:甲醇-0.3%甲酸水溶液=80∶20 (體積比);
(3)流速:0.3mL/min;
(4)柱溫:45℃;
(5)進樣量:15μL。
3.質譜條件
(1)選擇反應監測(SRM):青蒿素305.4→151.10,內標物青蒿乙醚335.2→163.10;
(2)正離子模式;
(3)去溶劑溫度:350℃;
(4)毛細管電壓:3.5kV
(5)提取電壓:2V;
(6)射頻鏡頭電壓:0.2V;
(7)錐電壓:40V;
(8)源溫度 100℃;
(9)去溶劑化氣體(氮氣):550L/h;
(10)錐氣體(氮氣):25L/h;
(11)碰撞能量:青蒿素22eV,青蒿乙醚21eV。
4.測定
準確吸取標準物溶液和樣品提取液各15μL分別注入色譜係統,以標準物的保留時間與選擇反應監測離子定性,通過內標方法計算青蒿素的含量。
(四)結果計算
參考文獻
Lie Li,Deepthi Pabbisetty,Paulo Carvalho,et al.. Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric method for the determination of Artemisinin in rat serum and its application in pharmacokinetics.Journal of Chromatography B,2008,867 (1):131~137.