超高效液相色譜與普通高效液相色譜原理相同，因此，在使用中應該注意的問題是相同的。要想成為一個合格的色譜分析者，良好的實驗規範與習慣是非常必要的。一些細小的失誤或忽視一些簡單的問題往往導致實驗結果不理想或損壞儀器，從而造成重大的損失。
在保證目標物回收率的情況下，盡量除去樣品其他雜質。
選用合適的濾膜（濾膜有水溶型、脂溶型、通用型，超高效液相色譜用0.2μm）過濾樣品，確保樣品中不含固體顆粒。最好使用與初始流動相組成相同的溶劑溶解樣品，在反相分析時，用比流動相極性更低的有機相（極性更弱的溶劑）；在用正相分析時，如在用親水色譜柱分析時，溶解樣品的一定是高極性有機相，否則，會引起色譜峰的變形，比如保留時間提前、雙峰等。
在保證靈敏度與準確度的前提下，進樣量要盡量小。