1.目的
（1）了解PCR反應的基本原理和引物設計的一般要求；
（2）掌握通過PCR反應獲取目的基因的實驗技術；
（3）熟悉PCR反應體係的加樣順序和PCR儀的正確使用方法；
（4）掌握PCR法檢測食品中大腸杆菌的原理和方法。
2.實驗原理
聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction）簡稱PCR技術，是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，依賴於DNA聚合酶的酶促反應。分三步：①變性，通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA；②退火，當溫度降低時由於模板分子結構較引物要複雜得多，而且反應體係中引物DNA量大大多於模板DNA，使引物和其互補的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補的機會較少；③延伸，在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的條件下，5′→3′的聚合酶催化以引物為起始點DNA鏈延伸反應。以上三個步驟為一個循環，每一循環產物可作為下一個循環的模板，幾十個循環後，介於兩個引物之間的特異性DNA片段得到大量複製，可達2×106～7拷貝。
引物的設計在PCR反應中極為重要，應遵循幾條原則：①堿基組成，G﹢C含量應在40%～60%，4種堿基要在引物中分配均勻，如沒有多聚嘌呤或多聚嘧啶的序列，並且沒有二核苷酸重複序列；②長度，18～25個核苷酸，上下遊引物的長度差別不能大於3bp；③不能有大於3bp的反向重複序列或自身互補序列的存在，這種序列可能成發夾結構，如果是這種結構在PCR條件下穩定，它會非常有效地組織寡聚核苷酸和靶DNA之間的複性；④一個引物的3′末端都不能和其他任何引物互補，否則會形成引物二聚體。精心設計引物，應用熱啟動PCR或降落PCR或特製的DNA聚合酶都可以避免二聚體形成；⑤解鏈溫度（Tm）：計算出兩個引物的Tm值相差不能大於5℃，擴增產物的Tm值與引物的Tm值相差不能大於10℃，這些特性保證了擴增產物在每個PCR循環可有效地變性；⑥3′末端，每個因為的3′末端堿基應盡可能為G或C，但又不推薦使用3′末端有……NNCG或……NNGC序列的引物，因為末端GC堿基高的自由能可以衝末發夾結構的形成，還可能產生二聚體；⑦向引物5′末端添加限製性酶切位點，噬菌體啟動子等序列，因為位於DNA分子5′末端的限製性酶切位點的切割效率比較低，所以，引物應當超出限製性內切酶識別位點2～3個核苷酸，即至少包含有2～3個保護堿基；⑧從cDNA或基因文庫中PCR擴增目的基因時，應注意引導位點的設置和簡並PCR引物的設計。
3.儀器與試劑
（1）主要儀器微量移液器、PCR儀、離心機、微波爐、電泳槽、電泳儀、紫外燈箱等。
（2）主要試劑模板DNA、Taq酶及其他PCR反應體係的成分、DNA標準Marker、進口瓊脂糖、TE、上樣緩衝液、無水乙醇等。
（3）大腸杆菌標準菌株
（4）引物設計以大腸杆菌丙氨酸消旋酶基因alr設計引物，引物序列所示。
4.重要實驗步驟
（1）LB培養基中模板DNA提取采用水煮法，取1mL菌液4500r/min離心15min，棄上清液，重複水洗一次，沉澱用50μL無菌水重懸後水煮6min，4500r/min離心5min，取上清液5μL作為PCR模板。
（2）取一個0.2mL的eppendorf管，在其中添加以下各種成分。
（4）將反應管放入PCR熱循環儀，按下列條件設計程序，進行PCR反應。
（5）反應結束後，取8μL反應液與2μL上樣緩衝液混合後用1.0％瓊脂糖凝膠電泳，以DNA marker作標準對照，鑒定PCR產物是否存在以及大小。
（6）將3個PCR反應產物混合在一個管子中，然後添加1/10體積的3mol/L的pH5.2 NaAc和2.5倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃冰箱中放置30min以上。12000r/min離心5min，將eppendorf管倒置於吸水紙上，室溫幹燥5min。
（7）30μL TE溶解沉澱，電泳確認回收PCR產物。
5.實驗注意事項
在實驗步驟（1）中，每組做三個重複反應，先在一個0.5mL的eppendorf管中配製4個反應的混合液（不加模板），然後分裝到已加入了模板的0.2μL的eppendorf管中。整個操作過程最好在冰上進行，尤其Taq酶一定要在冰上操作。