正文 第十五章 多焦視網膜電圖動物實驗研究(1 / 3)

動物實驗研究有助於進一步理解,弄清其波形成分視網膜起源;推動一些視網膜疾病如光感受器變性、實驗性青光眼等發病機製研究;為一些視網膜疾病千涉性治療如藥物治療、基因治療、移植等提供評價手段。近年來在不同種屬動物模型,運用多種方法如玻璃體藥物注射、視網膜內記錄以及波形提取等進行了大量研究。

第一節 研究方法

動物實驗研究與人研究方法不一樣,人與動物視網膜組織結構亦有不同,並且不同種屬之間也有很大差異,因此根據不同研究對象選擇合適的研究方法,包括麻醉、電極種類、記錄方法等。

一、麻醉與固視

在人記錄時可以保持較好的固視,而在動物記錄則很難保持,因此采用麻醉方法固定動物、抑製眼球運動。另外可采用附加裝置固定動物頭部,如用咬合棒和鼻夾等方法,也可采用利多卡因球後注射麻醉眼外肌方法。良好的麻醉可以減少肌肉不自主運動導致的偽跡,並可以最大限度抑製眼球運動,但不能完全消除。因此,在記錄中應保持監視,及時調整眼球位置或重新記錄。

動物實驗用監視器係統,固視是一個很大的問題。固視好壞很大程度依賴於麻醉種類和深度,沒有應用眼底同步監視係統很難發現一些緩慢的眼球運動和(或)旋轉。以往采用後投射方法即應用強光線投射到視網膜上,使視網膜結構影像投射到刺激屏幕上,再調整位置使中心四或中央區域對應於刺激區域的中央,或者在正式記錄前先用一個短序列進行記錄,以判斷視盤和(或)中心凹位置是否正確,再進行調整。但在麻醉情況下,眼球仍有相當大程度地運動和(或)旋轉,並且一段時間後眼球回複原位,因此,常規實驗方法很難保證較滿意固視。每次記錄前手工調整位置大大延長實驗時間。用激光掃描眼底鏡刺激和影像係統可以較好解決固視問題。

根據不同動物選擇不同的麻醉方法,常用戊巴比妥鈉或氯胺酮,用氯胺酮麻醉時需要3010追加劑量,以維持固視。一些麻醉藥物可能影響結果,因為這些藥物影響視網膜內層的神經遞質。用異氟烷麻醉獼猴,記錄發現一階函數核振幅增加;而高階函數核反應振幅降低227,(平均37%),振幅延長2~68;高頻振蕩電位和視盤成分消失。異氟烷改變視網膜內層反應成分,使振幅增加、潛伏期延長,主要原因是異氟烷對視網膜內層神經遞質影響。研究表明異氟烷增加遞質的抑製作用,增加鉀離子通道通透性,降低電壓門控性鈉通道50~70左右,並且同時抑製八受體興奮性,這些遞質對視網膜內層神經節細胞和無長突細胞信號傳遞有重要作用。利多卡因麻醉也抑製電壓門控性鈉通道,對實驗結果影響與異氟烷類似。在進行對照研究時,應采用相同的麻醉方法,以排除麻醉對實驗結果影響。

在麻醉過程中有必要監測心率和血氧飽和度,維持動物體溫,全視野研究表明動物體溫對波形有影響。動物麻醉複蘇需要一定時間,應待動物恢複正常後再進行下一次記錄。另外,還須觀察角膜上皮修複情況。

二、屈光

根據不同種屬動物屈光狀態,調節眼球與監視器距離,配戴角膜接觸鏡或眼鏡。靈長類動物實驗可采用與人一樣的接觸鏡或聚焦透鏡。鼠類實驗時可以不需要矯正,因為鼠眼為正視眼或輕微近視,並且有較大景深,理論上外物體都可以在鼠視網膜上清晰成像,因此通常記錄時,鼠眼距監視器,可以在視網膜上產生清晰刺激圖形。

三、眼球與瞳孔大小

檢查前用托品酰胺擴瞳,可以消除瞳孔大小因素影響。但不同種屬動物眼球和瞳孔大小迥異,因此即使刺激器給,同樣大小刺激光強度時,視網膜照度完全不同。因此,進行動物實驗研究時不僅考慮刺激器刺激光強度,還須考慮動物眼球和瞳孔大小。

四、記錄前光適應狀態

記錄前動物置於較暗的環境,避免強光刺激。若預先進行眼底照相或眼底熒光血管造影,則應暗適應後作花再記錄。

五、電極

所有對人類適用的角膜電極都可以用於動物實驗,也可使用玻璃體內電極和視網膜內電極。靈長類動物多采用電極或在角膜接觸鏡下安放電極,研究表明1隻猴眼安放電極,對側眼安放電極時能記錄到更大的視盤成分。鼠類動物多采用電極。

在記錄中應維持電極位置穩定性。另外若記較長時間,動物始終維持開瞼狀態,則記錄中應保持角膜水化,防止角膜上皮損傷。

六、刺激條件

根據不同實驗動物種屬的視網膜特性和研究目的選擇刺激參數,如刺激圖形等大還是不等大六邊形、六邊形數目、刺激器平均亮度、對比度、刺激光波長等。研究視錐細胞采用中央小周圍大或者等大六邊形和較大刺激強度,研究視杆細胞采用等大六邊形和較小刺激強度等大六邊形可減少散射光影響視杆細胞感暗光對短波長光敏感,因此研究視網膜以視杆細胞為主的動物時,宜采用較小強度、短波長刺激光。用激光掃描檢眼鏡刺激和影像係統的激光作刺激光時,須運用濾光片降低刺激強度。檢測視網膜內層成分和青光眼損害,可選擇較低對比度。

七、實驗設計和數據分析

依據研究問題結合實驗條件進行實驗設計。例如增加序列長度可以提高信噪比,但應考慮到長時間麻醉影響以及角膜情況,因此須選擇合適的實驗參數。依據要分析研究的目的(線性或非線性成分、低頻和高頻成分、區域分析等),分析實驗結果。

第二節 動物實驗研究

近年來,研究人員在靈長類(獼猴)、鼠類(大鼠、小鼠以及鼠句鼯)、貓、豬、免、雞等動物采取不同刺激方式、光感受器類型對視網膜組織結構和視網膜疾病進行各種研究。其中有關獼猴和鼠研究最多。

一、猴

靈長類動物視網膜結構和視覺信號傳遞與人類非常相似,並且具有黃斑中心四。因此,用靈長類動物研究有很大的優越性。

(一)記錄技術

研究在猴眼運用角膜接觸鏡安放電極或者六電極,103個笠大六邊形,最大刺激強度為200,最小刺激強度。