由於顧憲成在學界和政界都有很高的聲望，所以他返鄉後有很多人慕名前來請教。顧憲成不管其貧富貴賤，一視同仁，熱情接待。後來，人太多了，祠堂、客棧和自己周圍鄰居家都住滿了客人。顧憲成又在自己家南邊造了幾十間書舍供來人居住，他的夫人朱氏給學生們燒飯做菜，學生來了就像回到家裏一樣。涇溪南北，晝則書聲琅琅，夜則燭火輝輝，一派夜以繼日發奮攻讀的景象。顧憲成還經常被邀請到蘇州、常州、宜興等地去講學，與吳中學者聚會於無錫惠山第二泉畔研討學術。在講學活動中，顧憲成迫切感到需要一個固定的講學場所，使講學活動更有組織，以對社會產生更好的影響。無錫原來就有東林書院，是宋代楊時講道的場所。萬曆二十六年（1598）八月，顧憲成和其弟允成倡導修複東林書院。萬曆三十二年（1604），在地方士紳和官吏的資助下，東林書院修複完工，顧憲成偕同另外一些在仕途失意的好友在其中講學。這年十月，顧憲成會同顧允成、高攀龍、安希範、劉元珍、錢一本、薛敷教、葉茂才（時稱東林八君子）等人發起東林大會，製定了《東林會約》，每年一大會，每月一小會，定期講學。顧憲成首任東林書院主講，主持書院達八年之久，講學活動成為顧憲成一生事業的最輝煌時期。
東林講學是在特定曆史條件下，適應時代、社會和學人的共同需要興辦起來的。書院不分尊卑、不限地區、不論長少、不收學費，隻要願意，均可參加。講授方式十分靈活，有時采用演講方式，講了一段後，就穿插朗誦一段詩詞以活躍氣氛、開發性靈，主講者還隨時回答提問；有時采用討論方式，溝通思想、交流心得。講學內容更是廣泛、豐富，重視社會政治，關心世道人心，充滿了以天下為己任的救世精神。在東林書院的講堂裏，就掛有顧憲成青年時代寫的那副對聯：“風聲雨聲讀書聲聲聲入耳，家事國事天下事事事關心。”講學之餘，議論時政、臧否人物，把讀書、講學同關心國事緊緊地聯係在一起。這種政治性講學活動產生了廣泛的社會影響，在朝在野的各種政治代表人物、三吳士紳一時齊聚東林書院，並逐漸成為與朝中阿諛奉承、投機腐朽勢力相抗衡的一大政治派係。萬曆二十八年擁立朱常洛為太子的事件就是這一派係取得的一次重大勝利。他們還提出反對礦鹽稅使掠奪、減輕賦役負擔、發展東南地區經濟等主張，同時要求開放言路、抑製宦官和貴族特權、實行改良。這些針砭時政的意見得到社會的廣泛支持，同時也遭到宦官及其依附勢力的激烈反對，被政敵稱為“東林黨”。東林黨與朝廷中的腐朽勢力展開了殊死的鬥爭，顧憲成則以其卓越的思想氣度成為東林黨的精神領袖。同時，在朝廷內一度形成了宣、昆、齊、楚、浙等黨，這幾個派別相互傾軋爭權，但在麵對東林黨時，卻相互聲援，聯合起來栽贓陷害，將朝廷紛爭的全部責任推到東林官員頭上，說國家吏治、人品、學術都因顧憲成的東林講學而弄得敗壞不可收拾，汙蔑東林借講學之名，行結黨營私之實，目的就是想將朝中正直的人全搞倒。
天啟時，宦官魏忠賢專政，形成明代勢力最大的閹黨集團，開始了對東林黨人的血腥鎮壓。天啟四年（1624），東林黨人楊漣因彈劾魏忠賢二十四條大罪被捕，與左光鬥、黃尊素、周順昌等人同被殺害。魏忠賢又讓人編《三朝要典》，借梃擊、紅丸、移宮三案為題，打擊東林黨。一批東林著名人士如魏大中、顧大章、高攀龍等先後被迫害致死；還指使其黨羽編造《東林點將錄》，將主要的東林黨人分別加以《水滸》一百零八將綽號，企圖將其一網打盡。天啟五年（1625），熹宗下詔，燒毀全國書院。次年，東林書院首遭其災，東林書院變成一片瓦礫。天啟七年（1627），崇禎帝（思宗）即位，逮捕魏忠賢，大批閹黨被定為逆案，魏忠賢自縊而死，至此，對東林黨人的迫害才告停止。崇禎二年（1629），皇帝下令為東林黨人恢複名譽，並詔修東林書院。萬曆四十年（1612），顧憲成在張涇橋老家逝世，墓葬無錫查橋關涇村西南處，當地人稱“天官墳”。崇禎初追封顧憲成為吏部右侍郎，諡號“端文”。但明朝的黨派鬥爭一直延續到南明政權，直到清立國後才徹底結束。