對於司馬睿的行動，王導很快作出反應。他派遣八部從事巡行揚州諸郡。在聽取他們歸來的彙報時，王導對顧和的議論大加褒揚。顧和出身於吳郡望族，他反對朝廷對各級官吏所進行的調查，主張“寧使綱漏吞舟”，不“以察察為政”。這種縱容官吏貪汙、豪強兼並的主張正是王導施政的主導思想。王敦的反應遠比王導激烈，他寫了一封言辭激烈的上疏給司馬睿。在上疏中，王敦誇耀他們弟兄在草創東晉政權中的功勞，為王導在朝內所受的冷遇鳴不平，並發泄了對司馬睿的強烈不滿。他還威脅說：“聖恩不終，則遐邇失望，天下荒弊，人心易動”，表示要采取適當的行動。
王敦自恃專任閫外，手握強兵，有大功於江左，一向看不起司馬睿。司馬睿稱帝之時，王敦曾有心廢他。矛盾激化後，王敦逐漸滋生了取而代之的政治野心。他一直不敢貿然起兵，主要是畏懼兩位同樣掌握軍權的外藩：梁州刺史周訪和豫州刺史祖逖。
周訪升任梁州刺史是在公元317年10月。當時在荊州竟陵地區有一個以杜曾為首獨立的武裝力量。杜曾曾多次打敗過陶侃，並北襲襄陽、宛城，使王敦派去的荊州刺史王廙無法進入江陵。時任豫章太守的周訪受命救援。在沌陽，周訪以少勝多連敗杜曾，得封梁州刺史。公元319年，司馬睿以王廙在荊州濫殺引起民怨為由，將其調入建康，改派周訪為荊州刺史。王敦害怕周訪據大州對他構成威脅，遂自領荊州。當初，王敦懼怕杜曾，曾對周訪許願說，如能擒殺杜曾將薦舉他為荊州刺史。就在司馬睿調王廙入京之前，周訪攻滅了杜曾，但王敦並不履行諾言。周訪對王敦的出爾反爾、食言而肥的做法非常氣惱。他在襄陽努力務農訓兵，休養生息，伺機對王敦進行報複。
祖逖打敗石虎收複譙縣後，陸續降服了許多中原塢主和割據武裝，黃河以南的土地皆歸晉有。祖逖士馬強盛、糧儲豐足，隨時準備推鋒越河，掃清冀朔。祖逖的兵力雖然全部集中在北方前線，但是他的威望和影響卻對王敦有著巨大的震懾力，使得王敦不能不有所顧慮。公元320年8月，周訪病死。王敦消除了一塊心病，遂起用沈充、錢鳳等人積極謀劃起兵前的部署。
與此同時，司馬睿一麵繼續排斥王導，削弱他的實際權力；一麵努力布置對王敦的防範。公元320年年底，他拒絕王敦以沈充為湘州刺史的請求，派遣宗室譙王司馬承出鎮湘州。臨行前，司馬睿對叔父講，王敦圖謀不軌已經公開暴露，惠皇帝受製於強臣的命運離自己不會太遠了。湘州據大江上遊，控馭荊、交、廣三州，位置十分重要。他希望叔父去那裏能夠牽製王敦的行動。
鑒於東晉政府的絕大部分軍隊皆掌握在各地的外藩手中，司馬睿迫切地需要擴建能為自己所用的軍隊，以對付王敦。公元321年5月，在刁協的建議下，他下詔調發淪落到揚州地區大族家為奴或者為客的北方平民，免除他們的奴客身份，編入兵籍。司馬睿將他們分別配給親信劉隗和戴淵所統領的軍府。為保證詔令的順利執行，司馬睿頒布了給客製度。給客製度是在西晉蔭客製度基礎上，根據東晉社會的實際製定的政策。給客製度除對第一、二品官職蔭佃客戶數的規定比舊製有所減少外，以下各品皆有大幅度的增加，如第三品由原來的10戶增至35戶，第四品由7戶增至30戶，最低的八品、九品也由原來的1戶增至10戶、5戶。給客製度保留了舊製的蔭衣食客人數，又增加了蔭典計人數的規定。給客製度再一次從法律上肯定土族地主私占人口的權力，反映了東晉時期土族地主的強大以及皇權對它的軟弱和依賴。當然，這一製度同樣反映了地主國家同地主分子在勞動人手方麵的激烈爭奪。因為司馬睿頒布給客製度的主要目的是限製大族對國家人口的過度侵吞，並把他們超過規定的私占人口強征為國家所有。通過征客為兵，司馬睿得到了大量的兵員，配給劉、戴兩個軍府的人數各在萬人以上。