HPLC測定白頭翁皂苷D的油水分配係數及平衡溶解度
製劑與炮製
作者：饒小勇 尹姍 張國鬆 羅曉健 簡暉 馮育林 楊世林
[摘要] 目的：測定白頭翁皂苷D的油水分配係數及其在不同溶劑中的平衡溶解度。方法：采用搖瓶法與高效液相色譜法相結合測定白頭翁皂苷D的油水分配係數，采用高效液相色譜法測定白頭翁皂苷D在6種有機溶劑及不同pH緩衝液中的平衡溶解度。結果：白頭翁皂苷D在不同pH條件下油水分配係數大於零，隨著pH升高白頭翁皂苷D的平衡溶解度逐漸增加，在不同溶劑中白頭翁皂苷D的平衡溶解度以甲醇最大（達到255.89 g·L-1），乙腈中最小（0.20 g·L-1）。結論：在胃腸生理條件下，白頭翁皂苷D以分子狀態形式存在，由lgPapp可知其吸收性較好，但水溶性較差，提示增加白頭翁皂苷D的溶解度可能有利於提高其生物利用度。
[關鍵詞]HPLC；白頭翁皂苷D；油水分配係數；平衡溶解度
藥物的親脂性或疏水性影響著藥物在細胞膜的滲透性，油水分配係數和平衡溶解度是反映藥物脂溶性的2個不可或缺的重要理化參數，這2個重要理化參數對研究藥物的體內過程和指導臨床用藥具有重要的意義[1-3]。白頭翁皂苷D[4] （Pulsatilla saponin D，PSD）是從白頭翁中分離出來的一種常春藤皂苷，對HL-60腫瘤細胞和LLC腫瘤細胞具有很強的抑製作用[5-6]，筆者前期研究亦發現其對人肝癌細胞SMMC-7721、人結直腸腺癌細胞HCT116等腫瘤細胞具有較強的活性，說明白頭翁皂苷D具有成藥性的可能。由於白頭翁皂苷D的平衡溶解度和表觀油水分配係數未見相關報道，同時，為了進一步開展白頭翁皂苷D體內吸收過程及劑型研究，本文通過對白頭翁皂苷D平衡溶解度和表觀油水分配係數的測定以期為白頭翁皂苷D劑型合理選擇及藥動學研究提供參考。
1材料
白頭翁皂苷D對照品（中藥固體製劑製造技術國家工程研究中心對照品室提供，經MS，NMR鑒定、HPLC測定，純度在99%以上）；甲醇（上海振興化工一廠，色譜純）；磷酸二氫鈉（汕頭市西隴化工廠有限公司）；正辛醇（汕頭市西隴化工廠有限公司，分析純）；其他試劑均為分析純。
高效液相色譜儀：Agilent 1260色譜泵，二級管陣列檢測器（DAD），美國安捷倫科技公司；KQ-4000B型超聲清洗機（鞏義市予華儀器有限責任公司）；AL204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；TDL-40B飛鴿牌台式離心機（上海安亭科學儀器廠製造）；HH-2數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；Millipore Synergy 超純水係統（美國密理博公司）。
2方法與結果
2.1樣品的製備
2.1.1 正辛醇水飽和液的製備 精密吸取200 mL正辛醇至500 mL具塞錐形瓶，加水200 mL，置磁力攪拌器上，攪拌24 h，靜置，備用。
2.1.2 不同pH緩衝液的製備 按《中國藥典》（2010年版二部）附錄ⅩⅤD緩衝液的配製方法，分別配製pH為2.0，5.0，5.8，6.8，7.0，7.6的磷酸鹽緩衝液[7]。另稱取氯化鈉2 g、量取濃鹽酸7 mL至1 000 mL量瓶中，加水稀釋至刻度配成pH 1.2的緩衝液。
2.1.3 對照品溶液的製備 精密稱取白頭翁皂苷D對照品（五氧化二磷減壓幹燥24 h）13.6 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配製成0.544 g·L-1的對照品溶液。
2.2白頭翁皂苷D的含量測定
2.2.1 檢測波長的選擇 取白頭翁皂苷D對照品溶液，以甲醇為空白樣品，采用紫外分光光度法在190～400 nm進行全波長掃描，白頭翁皂苷D在203 nm處有最大吸收，因此選擇203 nm作為白頭翁皂苷D的檢測波長。
2.2.2 色譜條件與係統適用性試驗 Agilent 1260，大連依利特Hyperisil ODS2 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相甲醇-水-甲酸 （75∶25∶0.1），流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，紫外檢測波長203 nm。理論塔板數按白頭翁皂苷D計算不低於3 000，分離度大於1.5。
2.2.3 線性關係考察 取白頭翁皂苷D對照品溶液液（0.523 g·L-1），分別進樣1，2，5，10，15，20 μL。按2.2.2項下色譜條件進行測定，分別記錄白頭翁皂苷D的峰麵積。以進樣濃度（Y）為橫坐標，峰麵積（X）為縱坐標作圖並進行線性回歸，得線性方程Y=3 320.1X-8.914 6，r=0.999 9（n=6），結果表明白頭翁皂苷D進樣質量濃度在0.052 3～1.046 0 g·L-1呈良好線性關係。
2.2.4 精密度試驗 精密吸取白頭翁皂苷D對照品溶液，按上述色譜條件連續進樣6次，每次進樣10 μL分別記錄峰麵積，結果RSD 1.6%，說明該方法精密度良好。
2.2.5 穩定性試驗 取已知不同表觀油水分配係數及不同溶劑下的供試品溶液，分別在0，1，2，6，12，24 h條件下取樣，按上述色譜條件進樣10 μL進行檢測並記錄峰麵積，結果RSD均小於2%，表明所有供試品溶液在24 h內基本穩定。
2.3白頭翁皂苷D表觀油水分配係數的測定
精密稱取白頭翁皂苷D樣品0.026 4 g，置50 mL水飽和的正辛醇溶液，超聲溶解，離心15 min（4 000 r·min-1），備用。精密吸取含白頭翁皂苷D的水飽和正辛醇2 mL，置10 mL具塞塑料管中，分別加入2 mL正辛醇飽和水及不同pH的磷酸鹽緩衝液，將具塞塑料管放入恒溫振蕩器中，控製溫度（25±1） ℃，振搖72 h直至平衡，4 000 r·min-1離心10 min，取上層正辛醇溶液，按照上述色譜條件進樣10 μL進行測定，記錄峰麵積。分別計算其濃度，並按下式計算表觀油水分配係數。Papp=（CV-CwVw）/ CwVw ，式中Papp為白頭翁皂苷D的表觀油水分配係數；C為正辛醇中白頭翁皂苷D的初始濃度，V為水飽和正辛醇的體積（即2.0 mL）；Cw為分配平衡時白頭翁皂苷D在水相中測得的濃度，Vw為水相體積（即2.0 mL）。按照公式計算不同pH磷酸鹽緩衝溶液中表觀正辛醇/緩衝溶液分配係數。