UPLC同時測定蒸製三七中的10種人參皂苷類活性成分的含量
製劑與炮製
作者：陳斌 蔡濤 賈曉斌
[摘要]該文建立了蒸製三七中人參皂苷Rg6，F4，Rk3，Rh4，20（S）-Rg3，20（R）-Rg3，Rk1，Rg5，20（S）-Rh2，20（R）-Rh2 10種皂苷類活性成分同時含量測定的超高效液相色譜方法，並對其不同頭數、不同藥用部位、不同蒸製時間的樣品進行含量測定和質量控製研究。所采用的色譜條件為ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相乙腈-水，梯度洗脫，流速0.3 mL·min-1，檢測波長203 nm，柱溫35 ℃。結果顯示，人參皂苷Rg6，F4，Rk3，Rh4，20（S）-Rg3，20（R）-Rg3，Rk1，Rg5，20（S）-Rh2，20（R）-Rh2分別在0.46～115，2.06～515，1.632～408，3.216～804，1.392～348，1.4～350，0.496～248，3.012～1 506，0.82～205，0.832～208 mg·L-1具有良好的線性關係（R2≥0.999 8），平均回收率分別為97.00%，97.96%，98.86%，95.27%，98.67%，98.02%，95.53%，96.63%，99.57%，103.6%。該方法快速、準確、重複性好、分離度高，可有效控製蒸製三七的質量，為製定其規範化炮製工藝和質量標準，確保其臨床療效的可靠性與一致性奠定了基礎。
[關鍵詞]蒸製三七；人參皂苷；UPLC；多成分同時測定；質量控製
三七為五加科植物三七Panax notoginseng （Burk.）F.H.Chen的幹燥根，主產於雲南、廣西等地。《本草綱目拾遺》記載：“人參補氣第一，三七補血第一，味同而功亦等”，為我國名貴中藥。據中國傳統古籍記載，三七生品具有止血、散瘀、消腫、止痛等功效[1]；炮製品具有補血、增強免疫功能、抑製腫瘤、強壯、生肌等功效[1-2]。熟三七的傳統炮製方法有蒸製、油炸、熏製、黑豆汁蒸製等[3]，由於社會經濟的發展以及炮製加工條件的改變，現代采用最常用、便捷的炮製方法為蒸製，本文中的熟三七即指蒸製三七。
現代研究表明三七的主要有效成分為皂苷類化合物，代表了三七大部分生物活性。近年來研究發現，三七炮製前後成分變化差異較大。蒸製三七中含有大量的不同於生三七的皂苷類化合物[4]，據報道，從蒸製三七活性部位中分離得到的皂苷類化合物有人參皂苷Rg3，Rg6，F4，Rh4，Rk3，Rg5，Rk1，Rh2等[5-6]。藥理試驗表明以人參皂苷Rg3，Rg6，F4，Rh4，Rk3，Rk1，Rg5等為代表的皂苷類化合物具有增強免疫功能、抑製腫瘤等多種生物活性[7-11]，多種皂苷類成分的配伍是蒸製三七發揮臨床療效的物質基礎。因此考慮將其作為蒸製三七飲片含量測定的指標成分。
三七在臨床上的使用同樣有生熟之分，兩者功用俱佳但存在顯著差異，是中藥炮製理論“生消熟補”的典型藥[12]。但2010年版《中國藥典》隻收載了三七藥材及其飲片三七粉，並未收錄其他炮製品種。事實上，正因為《中國藥典》中未收錄炮製品熟三七，導致在目前國內中醫臨床上，生三七及其炮製品熟三七經常作為同一飲片“三七”同樣使用；國外如新加坡等東南亞市場上也有多種劑型生、熟三七製品在作為補品“三七”銷售。對於國外使用者甚至大部分國內使用者來說並不了解中醫在遣藥組方時講究“藥之生熟，生熟效異，各有其功，用法不同”。因此很可能會因無法辨識生、熟三七而混用、錯用，導致不良後果[13]。
為客觀地評價和控製三七炮製品，即蒸製三七的質量，筆者建立了同一UPLC色譜條件下分離、測定蒸製三七中人參皂苷Rg6，F4，Rk3，Rh4，20（S）-Rg3，20（R）-Rg3，Rk1，Rg5，20（S）-Rh2，20（R）-Rh2等10種活性成分的方法，並對不同頭數、不同部位、不同蒸製時間的熟三七進行了10種成分含量變化的研究。該方法靈敏、高效、準確，可為蒸製三七飲片的質量控製提供快速準確的檢測方法，並為製定熟三七質量標準提供依據。
1材料
ACQUITY UPLC（ 美國Waters 公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower2 色譜工作站），梅特勒1/10萬電子天平，Millipore超濾儀。
蒸製三七，收集雲南產不同頭數的三七飲片和三七根須，於實驗室常壓蒸鍋100 ℃蒸製不同時間後即得。人參皂苷20（S）-Rg3（純度≥98%，批號MUST-11041211），20（R）-Rg3（純度≥98%，批號MUST-11080811），20（S）-Rh2（純度≥98%，批號MUST-11091602），20（R）-Rh2（純度≥93.44%，批號MUST-12032601）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；人參皂苷Rg6（純度≥98%），F4（純度≥98%），Rk3（純度≥98%），Rh4（純度≥98%），Rg5（純度≥98%），人參皂苷Rk1（純度≥95.04%）均為本實驗室自製。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純。
2方法與結果
2.1對照品溶液的製備 分別精密稱取人參皂苷Rg6，F4，Rk3，Rh4，20（S）-Rg3，20（R）-Rg3，Rk1，Rg5，20（S）-Rh2，20（R）-Rh2對照品1.15，5.15，4.08，8.04，3.48，3.50，2.48，15.06，2.05，2.08 mg置於10 mL量瓶中，加少量甲醇溶解後用甲醇定容，製得混合對照品儲備液。
2.2供試品溶液的製備 取不同頭數蒸製三七飲片粉末1 g，精密稱定，置三角燒瓶中，加甲醇50 mL，超聲提取40 min後過濾，收集濾液，置水浴鍋上揮去甲醇，加甲醇溶解殘渣，並定容置10 mL量瓶中，搖勻，過0.45 μm的微孔濾膜，取續濾液即得。
2.3色譜方法 ACQUITY BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm， 1.7 μm）；流動相水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～4 min，20%～28% B；4～4.5 min，28%～36% B；4.5～8 min，36%～43% B；8～14 min，43%～50% B；14～14.5 min，50%～64% B；14.5～20 min，64%～100% B。流速0.3 mL·min-1；柱溫35 ℃；檢測波長203 nm。
2.4線性關係考察 取2.1項下混合對照品儲備液分別稀釋2，5，10，20，40，80，100，250倍，得到一係列濃度的混合對照品溶液，按2.3項下色譜條件，進樣2 μL。以峰麵積積分（Y）對濃度（X）進行線性回歸，得到10種皂苷類成分的回歸方程、相關係數、線性範圍、檢測限和定量限。
2.5精密度試驗 對於日內精密度，按2.2項下製備30頭三七蒸製10 h供試品溶液（批號1010158），取2.1項下混合對照品儲備液適量加甲醇稀釋10倍的溶液，分別精密吸取2 μL，以2.3項下色譜條件分別連續進樣6次；對於日間精密度，連續3 d同法測定，計算峰麵積的相對標準偏差。結果30頭三七蒸製10 h供試品溶液和混合對照品溶液各指標成分日內、日間精密度的RSD均小於3%，表明精密度良好。
2.6重複性試驗 取同一批30頭三七蒸製10 h樣品（批號1010158），精密稱定，分別製備6份供試品溶液，按2.3項下色譜條件進樣2 μL，計算峰麵積的相對標準偏差。結果顯示，供試品溶液各指標成分的RSD均小於4%，表明重複性較好。
2.7穩定性試驗 精密吸取同一批30頭三七蒸製10 h供試品溶液2 μL，分別於配製後0，1，2，3，6 h時進樣，考察其穩定性，計算峰麵積的相對標準偏差，供試品溶液各指標成分的RSD均小於3.5%，表明供試品溶液在6 h內各成分均穩定。