黃酮類化合物抑菌作用研究進展
綜述
作者：遊庭活 劉凡 溫露 鄒宇曉 廖森泰 肖更生
[摘要]細菌耐藥性是全球公共衛生麵臨的最嚴重的威脅之一，迫切需要尋找到新的有效的治療藥物。黃酮是廣泛存在於植物中的一大類化合物，具有直接抑菌、協同抑菌及抑製細菌毒性等作用。本文主要對2005年以來黃酮類化合物抑菌作用及其機製研究進展進行概述。
[關鍵詞]黃酮；抑菌活性；協同作用；構效關係；作用機製
[收稿日期]2013-05-21
[基金項目]國家現代農業產業技術體係建設專項（CARS-22）；廣東省自然科學基金團隊項目（粵科基字[2009]2號）；廣東省自然科學基金博士啟動項目（粵科基字[2010]3號）；廣東省農科院院長基金（）；廣州市珠江科技新星專項（）
[通信作者]*廖森泰，研究員，碩士生導師，Tel：（020），E-mail： liaost@163、com；*劉凡，博士，助理研究員，Tel：（020），E-mail： liufan1234@126、com
[作者簡介]遊庭活，碩士研究生，，E-mail： youtinghuo@126、com由於抗生素的濫用，病原菌日益廣泛的耐藥性已經成為21世紀全球公共衛生麵臨的最嚴峻挑戰之一[1]。據統計，一種新的抗菌藥物從研製到臨床應用一般需要5～10年，而細菌產生耐藥僅需2～3年。因此，研發新的抗菌藥物已經成為醫藥產業麵臨的迫切任務。基於目前抗菌藥物的研究現狀，天然產物的抑菌作用受到了普遍關注，尤其是黃酮類化合物，已經成為近年來研究的熱點之一[2]。大量文獻證明，自然界中從低等植物到高等植物，源自植物的花、葉、種子、果實以及根、莖中提取的許多類黃酮，均具有抑菌作用[3-5]。關於黃酮類化合物抑菌活性的研究也有較多綜述，而本文重點對自2005年以來在黃酮類化合物的抑菌活性、構效關係及作用機製等方麵取得的研究進展作一綜述。
1黃酮結構特征與分類
黃酮類化合物是廣泛存在於自然界的一大類化合物。黃酮類化合物是指2個苯環（A環與B環）通過C3連接而成的一係列化合物，也就是具有C6-C3-C6結構，並且是以2-苯基色原酮為母核的化合物。現代研究證實，黃酮的基本骨架中A環源於3個丙二酰輔酶A，而B環由桂皮酰輔酶A生物合成而來[6]。自然界中黃酮類化合物多以苷類形式存在，由於苷元不同，以及糖的種類、數量、連接位置和連接方式的不同，使自然界中形成了數目眾多、結構各異的黃酮類化合物。
根據黃酮類化合物A環和B環中間的C3鏈的氧化程度、C3鏈是否成環等結構特征，可將黃酮類化合物分為：黃酮（flavone）、二氫黃酮（flavonone）、黃酮醇（flavonol）、二氫黃酮醇（flavanonol）、異黃酮（isoflavone）、二氫異黃酮（isoflavanone）、查耳酮（chalcone）、二氫查耳酮（dihydrochalcone）、橙酮（aurone）、花色素（anthocyanidins）、黃烷-3-醇（flavan-3-ol）、黃烷-3，4二醇（flavan-3，4-diols）、雙苯吡喃酮（xanthone）和雙黃酮（biflavonoids）等[7]。黃酮類化合物的主要化學結構。
2黃酮類化合物直接抑菌作用
2、1黃酮類化合物直接抑菌活性
自20世紀60年代以來，關於天然產物中黃酮類化合物抑菌活性的研究報道日益豐富。進入21世紀後，特別是最近幾年，對黃酮類化合物抑菌活性的研究更加廣泛、深入。有研究表明，某些從植物或蜂膠中獲得的黃酮提取物具有很強的抑菌活性，其最低抑菌濃度（MIC）甚至小於1、0 mg· L-1 [8-10]。黃酮類化合物在抑菌作用方麵表現出的良好活性，吸引了越來越多的科研人員開展相關研究。李國章等[5]研究發現超臨界CO2萃取的桑椹子總黃酮提取物對細菌和黴菌均具有抑製作用，對細菌的抑製作用更強。陳乃東等[4]還比較了不同提取溶劑對春花胡枝子總黃酮提取率及抑菌活性的影響。柯昌鬆等[11]采用濾紙片法對從番石榴葉中得到的黃酮類化合物——槲皮素進行了抑菌活性研究，發現槲皮素對大腸杆菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、誌賀氏菌及枯草芽孢杆菌均有抑製作用，其中對大腸杆菌和沙門氏菌的抑製作用最強。魏福華等[12]研究發現大豆異黃酮及其水解苷元對大腸杆菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙門氏菌均有一定的抑菌活性，且存在濃度依賴效應，大豆異黃酮對革蘭陽性菌的抑製效果優於革蘭陰性菌。
2、2構效關係研究
總體來說，關於黃酮類化合物抑菌活性構效關係的研究報道相對較少。2005年，Cushnie等[13]對此前黃酮類化合物
圖1黃酮類化合物的主要結構
Fig、1Skeleton structures of the main classes of flavonoids
抑菌活性構效關係的研究進行了綜述。近年來，對於黃酮化合物抑菌活性的構效關係有了更為深入的研究。從結構特征上可以發現，查耳酮（包括二氫查耳酮）具有其他黃酮類化合物所沒有的C3鏈開環結構。雖然很多研究結果表明，對開環結構的查耳酮具有活性增益效果的結構單元對其他黃酮類化合物同樣具有增效作用，但是為了更為清晰地闡明黃酮類化合物抑菌活性的構效關係，本文仍將黃酮類化合物分為查耳酮（包括二氫查耳酮）和其他黃酮類化合物分別進行闡述。
2、2、1查耳酮類對於A環：綜觀前人研究可以發現，A環的羥基化及親脂性對查耳酮的抑菌活性很重要。Avila等[14]研究證明，查耳酮A環的2′位的羥基化能增強其抑菌活性，並發現這種增效作用可能是通過促進查耳酮結構穩定性而間接實現的。Liu X L等[15]發現，A環4′位的羥基化也能提高查耳酮的抑菌活性。Alvarez M D等[16]研究表明，A環其他位置的羥基化也能提高查耳酮的抑菌活性。Avila[14]和Batovska等[17]的研究都表明，A環的親脂性對於查耳酮的抑菌活性很重要。A環上3′位的異戊二烯基取代能顯著增強查耳酮的抑菌活性，而A環2′位的乙酰氧基化或甲氧基化以及A環3′和5′位的氟取代都會降低查耳酮的抑菌活性。但奇特的是，Nielsen[18]發現A環4′位的羰基化能提高查耳酮的水溶性近60倍，卻對其抑菌活性影響很小。
對於B環：在B環4位上的取代對於查耳酮的抑菌作用十分重要。Nowakowska等[19]研究表明，B環4位上的C6鏈烷基取代、呱啶基取代或羥基取代能增強查耳酮的抑菌活性。Batovska等[17]研究表明，相對於A環的親脂性，查耳酮B環上的羥基化對其抑菌活性的增效作用並不明顯。B環3位或5位上的三氟甲基或三溴甲基取代也能提高查耳酮的抑菌活性。
2、2、2其他黃酮類化合物對於A環：7位上O-酰基取代[20]或O-烷胺基取代[21]都能提高這類黃酮化合物的抑菌活性。Smejkal等[22]研究表明，A環5位上的羥基化對增強黃酮類化合物的抑菌活性同樣重要。Li H Q等[23]發現A環的6位或者8位上的親脂性取代基團也能增強黃酮類化合物的抑菌活性。
對於B環上取代基的構效關係研究相對較少。Smejkal[22]等的研究表明，B環上的甲氧基取代會削弱黃酮類化合物的抑菌活性。
對於C環，3位上的羥基化能增強黃酮類化合物的抑菌活性。越來越多的研究表明，3位上的O-酰基取代或O-烷基取代能增強黃酮類化合物的抑菌活性[24-25]。Mughal等[26]研究表明，C環4位上的O被S或N取代，能明顯增強黃酮類化合物的抑菌活性。
2、3作用機製研究
2005年之前的研究中，大致將黃酮類化合物的直接抑菌作用機製歸納為3種：一是降低膜的流動性或者膜穿孔而導致細菌細胞質膜的損傷[27-28]；二是抑製拓撲異構酶活性進而抑製細菌核酸的合成[29]；三是抑製NADH-細胞色素C還原酶活性而抑製細菌的能量代謝[30]。
近年來，對於黃酮類化合物的直接抑菌作用機製有了更進一步的研究。越來越多的研究再次證明了以上3種作用機製。研究表明，黃酮醇類、黃烷-3-醇類和黃烷酮類能通過過氧化氫途徑破壞細胞質膜從而抑製細菌生長[31-33]，黃烷-3-酯與異黃酮類則可通過抑製拓撲異構酶活性[34]或抑製二氫葉酸還原酶活性[35]來抑製細菌核酸的合成。Chinnam N等[36]證實黃烷-3-醇和黃酮類的抑菌機製是通過抑製ATP合成酶活性，進而抑製細菌的能量代謝來產生抑菌活性。另外，近期的研究還提出了2種新的作用機製：一是通過抑製D-丙氨酸-D-丙氨酸連接酶活性[37]而抑製細菌細胞壁的合成；二是通過抑製FabG，FabI，FabZ，Rv0636，KAS III等關鍵酶的活性[38-41]，而抑製細菌細胞膜的合成。
至此，作者認為黃酮類化合物抑菌作用機製可以擴展為5種：一是損傷細菌細胞質膜；二是抑製細菌核酸的合成；三是抑製細菌的能量代謝；四是抑製細菌細胞壁的合成；五是抑製細菌細胞膜的合成。
但是，上述大多數研究隻是針對一、兩個化合物進行的。因此，在很長一段時間裏，對於黃酮類化合物是否：①每種不同結構的黃酮類化合物具有其獨立抑菌作用機製；②所有的黃酮類化合物都有多途徑的抑菌作用機製；③所有的黃酮類化合物都具有同樣的單一途徑抑菌作用機製，仍然還有爭論。
由於大多數黃酮類化合物在結構上存在很大的相似性，研究者們普遍認為關於每種不同結構的黃酮類化合物具有其獨立抑菌作用機製的假說成立的可能性最小。此外，近年來對於黃酮類化合物的抑菌活性研究進展較快，越來越多的活性黃酮如槲皮素被多次研究，並且得出了多種作用機製。這就使得另外2種假說，所有的黃酮類化合物都具有多途徑的抑菌作用機製或者具有同樣的單一作用機製，更能為人們所接受。
盡管許多研究都認為黃酮類化合物應該具有多途徑的抑菌作用機製[42]，但是最近的研究進展表明多途徑作用機製假說並不一定可靠。例如，Li B H等[43]研究發現表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對從大腸杆菌中分離提取的FabG酶有聚集作用，但是目前尚不清楚EGCG是否對其他的酶也有聚集效果或其他的黃酮類化合物對類似酶也有同樣的聚集作用。更重要的是，這一研究結果，更加使人們對通過體外純化的酶抑製試驗來探討黃酮類化合物的抑菌作用機製的結果產生懷疑：黃酮類化合物抑菌作用可能源於引起相關酶的聚集，而非對酶的特異性抑製。
此外，在一些關於抑菌作用機製的研究中，可能存在著“因果關係”的混淆。例如，如果一個抑菌藥物破壞了細菌的細胞質膜，那麼必將引起質子動力勢的混亂，繼而影響ATP的生成和胞內外物質的運輸。又例如，如果細菌細胞能量代謝或營養代謝的能力降低，那麼其合成DNA及肽聚糖的能力也將減弱。在這種情況下，人們很容易將一個單一途徑的抑菌作用機製誤認為多途徑的抑菌作用機製。同樣地，如果一個抑菌藥物抑製了細菌DNA回旋酶的活性，那麼可能引發細菌細胞的程序性死亡與自溶。在這種情況下，抑製細菌核酸合成途徑的抑菌作用機製很有可能被誤認為是破壞細菌細胞質膜途徑的作用機製。
3黃酮類化合物的協同抑菌作用
3、1黃酮類化合物的協同抑菌活性研究
近年來，有很多關於黃酮類化合物增強抗生素抑菌活性的研究報道。盡管研究所采用的方法不盡相同，但是都通過部分抑菌濃度指數（FICI）分析表明，黃酮類化合物對抗生素抑菌活性的增效作用是真正的協同作用而非簡單的加和作用[44-46]。在所有黃酮類化合物中，黃烷-3-醇類化合物的抑菌協同作用最受關注，也研究的最為深入。Stapleton等[47]研究發現沒食子酰基黃烷-3-醇類，如（-）-表兒茶素沒食子酸酯能夠增強β-內酰胺類抗生素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的抑菌活性約512倍。農朝讚等[48]研究證實黃酮類化合物與大環內酯類抗生素具有協同抗菌作用，其作用機製可能是兩者化學結構上具有互補性，有望成為藥物工業生產抗菌新藥的根據。
3、2構效關係研究
相對於直接抑菌作用，黃酮類化合物協同抑菌作用的構效關係研究還較少。然而，關於黃烷-3-醇的研究結果明確證實，沒食子酰基或沒食子酸酯基團對於黃烷-3-醇增強β-內酰胺酶對MRSA的抑製活性至關重要[47]。另外，有研究表明，在A環5位、7位以及B環上的羥基化對於黃酮類、黃酮醇類、黃烷酮或黃烷-3-醇類化合物增強異煙肼對結核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的抑菌活性具有重要作用[44]。
3、3作用機製研究
研究表明，沒食子酰黃烷-3-醇可能通過減弱細菌細胞壁磷壁酸的D-丙氨酰化作用，或致使青黴素結合蛋白2a （PBP2a）失活及離位，從而實現對β-內酰胺抑菌活性的調節[49-50]。其作用機製可能是抑製了PBP2a的表達或促進了黃烷-3-醇與肽聚糖的結合[51]。對於其他黃酮類化合物，如黃酮、異黃酮、黃酮醇、黃烷酮等，有研究表明，這些化合物可能通過導致細菌細胞外排泵失活，或幹擾細胞質膜穩定性，或阻斷PBP2a的合成，或抑製拓撲異構酶活性等途徑來增強β-內酰胺類抗生素的抑菌活性[52-53]。
4黃酮類化合物對細菌致病性的影響
4、1抑製分選酶的活性
許多革蘭陽性菌的表麵蛋白都是經過分選酶的催化作用而組裝、錨定到細胞壁上，由於表麵蛋白在病原菌的致病性方麵起關鍵作用，所以分選酶有可能成為降低革蘭陽性菌致病性的重要藥物靶標[54]。Kang等[55]在細胞水平上研究了桑色素對金黃色葡萄球菌分選酶A和分選酶B的活性，結果表明，經桑色素處理後，金黃色葡萄球菌與纖維蛋白原的結合能力明顯下降，進而導致其致病性明顯減弱。同時還表明，桑色素對細菌分選酶的抑製作用是特異性的。這也證明，對分選酶的抑製作用可能是黃酮類化合物（如黃烷3-醇，黃烷酮）抑製革蘭陽性菌感染的重要途徑。
4、2中和細菌毒素
細菌毒素在細菌致病性方麵發揮著重要作用，甚至在細菌本身死亡後細菌毒素仍能發揮作用。最新研究表明，黃酮類化合物能夠中和細菌毒素從而抑製細菌致病性。Choi等[56]通過體內、體外試驗證實，兒茶素多聚體能夠中和金黃色葡萄球菌毒素。Oh等[57]研究表明，異黃酮也能中和細菌毒素，如經過金雀異黃素（genistein）處理過的HeLa細胞能夠防禦創傷弧菌（Vibrio vulnificus）毒素RtxA1的損傷。動物試驗也證實，金雀異黃素對創傷弧菌在CD-1小鼠體內感染也有一定的保護作用。此外，Delehanty等[58]研究表明，兒茶素和表兒茶素的聚合物能夠中和內毒素即脂多糖（LPS）。並且在膿毒性休克的發展早期，類黃酮化合物能阻斷LPS和其受體TLR4/MD2，CD14之間的相互作用。