阿魏酸對坐骨神經結紮小鼠的鎮痛作用：行為學和神經生化分析
藥理
作者：呂衛紅 張璐 吳淑娟 陳賽貞 朱新波 潘建春
[摘要] 研究阿魏酸慢性給藥的鎮痛作用，初步探討其作用機製。采用熱覺過敏和機械超敏實驗，觀察阿魏酸慢性給藥對坐骨神經結紮（CCI）小鼠的影響。應用神經化學檢測方法，觀察阿魏酸慢性給藥對單胺遞質和單胺氧化酶活性的影響。與正常組相比，CCI小鼠的熱覺和機械性痛閾都顯著降低，而阿魏酸（10，20，40， 80 mg·kg-1， po）能顯著逆轉這一現象。進一步深入研究發現造成這種結果的原因是阿魏酸能劑量依賴性地增加海馬、額葉皮層和杏仁核的5-HT和NE水平，並能抑製腦內MAO-A的活性。阿魏酸具有鎮痛作用，其機製可能與抑製腦內單胺氧化酶活性，進而增加腦內胺類神經遞質有關。
[關鍵詞] 阿魏酸；疼痛；單胺遞質；單胺氧化酶
[收稿日期] 2013-04-23
[基金項目] 浙江省中西醫結合學會科研項目（2012LY011）
[通信作者] *潘建春，教授，碩士生導師，Tel：（0577），E-mail：wenzhoupan2003@163、com 神經痛是神經科常見症狀之一，其特征是對有害刺激過度響應（痛覺過敏）、對早前無害的刺激產生疼痛感（痛覺超敏）以及自發疼痛[1]。臨床上有許多患者對於典型鎮痛藥（比如阿片類和非甾體類抗炎藥）產生耐受性，因此尋找更為有效的鎮痛藥物顯得尤為重要。而抗抑鬱藥（如去甲替林）和抗驚厥藥（如加巴噴丁）雖然作為一線藥物，但是卻未能很好地減輕患者的神經痛症狀，並且還伴有不良反應[2-3]。隨著天然藥物在精神病治療中使用的越來越多，而且其具有多靶點、低毒的優點，因此，從天然植物中開發安全有效、毒副作用小、生物利用度高的天然藥物用於鎮痛成為這一領域的研究方向。
阿魏酸（ferulic acid，3-甲氧基-4-羥基肉桂酸），是植物界廣泛存在的一種低毒酚酸，它是阿魏、川芎、當歸、升麻、木賊等多種中藥的有效成分之一，在細胞壁與多糖和蛋白結合，形成細胞骨架。由於結構中的酚羥基，其具有很強的抗氧化活性，對過氧化氫、超氧自由基、羥自由基、過氧化亞硝基都具有強烈的清除作用[4]。阿魏酸能增加抑凋亡基因（Bcl-2）表達，減少促凋亡基因（Bax）表達，從而抑製氧化損傷，起到抗氧化作用。阿魏酸能明顯抑製腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞白介素1β（IL-1β）的升高，表明其通過抑製炎症反應而發揮作用，維護缺血區域神經元的基本結構和功能。程斯[5]研究發現，氟桂利嗪與阿魏酸鈉聯用治療偏頭痛的效果較單用氟桂利嗪有效率高，表明阿魏酸具有一定的鎮痛作用。而坐骨神經結紮（chronic constriction injury of sciatic nerve，CCI）模型是目前公認的神經病理性疼痛模型，因此本研究就阿魏酸對CCI模型小鼠行為學的影響來探討阿魏酸的鎮痛作用及其初步機製。
1 材料與方法
1、1 藥品和試劑阿魏酸、鹽酸丙咪嗪、5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）、5-羥基異丁酸（5-HIAA）及二羥苯乙酸（DOPAC）均購於 Sigma 公司（美國）。阿魏酸（10，20，40，80 mg·kg-1）溶解於雙蒸水，灌胃給藥；丙咪嗪（imipramine，10 mg·kg-1）用雙蒸水溶解，腹腔給藥。
1、2 儀器 BS-11OS 型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；WH-966漩渦混合器（太倉市科教器材廠）；Bio-RAD 680酶標儀（美國伯樂公司）；Agilent 1100高效液相儀（美國Agilent公司）；ANTEC電化學檢測器（荷蘭安泰克公司）；64R超速冷凍離心機（BECKMAN COULTER公司）；RF-5301PC型熒光分光光度計（日本島津公司）；JY92-2D超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；超低溫保存箱（海爾公司）。
1、3 動物雄性ICR小鼠64隻，SPF級，體重25～30 g，由溫州醫學院動物中心提供，許可證號SCXK（浙）2010-0044。飼養條件：6 隻/籠，室溫（24±1）℃，濕度（50±10）%，自然光照，晝夜節律，自由攝食飲水。所有動物適應環境5 d後開始實驗，實驗前禁食10 h，自由飲水。隨機分成8組，分別為空白對照組、假手術組、CCI組[溶媒組、阿魏酸組（10，20，40，80 mg·kg-1）、丙咪嗪組（10 mg·kg-1）]，每組8 隻動物。
1、4 CCI模型建立[6] 小鼠在戊巴比妥麻醉下，於右側大腿中部切開，暴露坐骨神經，於坐骨神經幹上用4-0鉻製羊腸線結紮3道鬆緊適中的結，以不影響神經的血液循環為原則，每2道之間間隔1 mm，然後將鏈黴素灑在切口上，逐層縫合切口。假手術組僅暴露坐骨神經不作結紮。
1、5 熱覺過敏的測定[7] 將小鼠靜置於底部為玻璃板的透明小室中，靜置30 min後，輻射熱光源對準小鼠右足掌正中照射，記錄縮足反應的潛伏期作為熱痛閾。超過20 s仍無縮足反應停止照射以免造成組織損傷。
1、6 機械超敏的測定[8] 采用一係列的Von Frey 纖維細絲測定小鼠的機械性縮足閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）。將小鼠單獨置於一帶有金屬篩網的有機玻璃箱（5 cm × 5 cm × 10 cm）內適應至少20 min，使用Von Frey 纖維細絲（0、16，0、4，0、6，0、8，1、0，1、4，2、5，3，4、6，6 g）刺激小鼠右後腿足底中部。當小鼠出現快速抬足遠離細絲或舔足行為視為陽性反應，反之為陰性反應。首先從 1、0 g 開始測試，因為這是中間值。當陽性反應或陰性反應出現後，再給予相鄰小一級力度或者相鄰大一級力度的刺激，如此連續進行5次。每次刺激間隔30 s。
1、7 腦內單胺含量測定[9-10] 行為學測試結束後將小鼠斷頭取腦，迅速剝離全腦，分離出海馬、額葉皮質和杏仁核，稱重。每100 mg腦組織在200 μL冰冷0、4 mol·L-1高氯酸（溶液A）中超聲勻漿。勻漿液避光放於冰上1 h，然後12 000 r·min-1 4 ℃離心20 min，丟棄沉澱。160 μL上清液加入至80 μL的溶液B（0、2 mol·L-1檸檬酸、0、3 mol·L-1磷酸氫二鉀、0、2 mol·L-1 EDTA）。混合液避光在冰上孵育1 h，12 000 r·min-14 ℃離心20 min。20 μL的上清液直接加入到裝有C18反相柱（4、6 mm×150 mm，5 μm）和電化學檢測器（ESA CoulArray，Chelmstord，MA，USA）的高效液相中，流動相組成為125 mmol·L-1枸櫞酸-檸檬酸鈉緩衝液（pH 4、3），0、1 mmol·L-1 EDTA，1、2 mmol·L-1辛烷基磺酸鈉和16%甲醇。流速1、0 mL·min-1。腦組織中單胺及其代謝產物的含量以ng·g-1濕組織重表示。
1、8 單胺氧化酶測定[11-12] 腦組織稱重後加入4 mL冰冷磷酸緩衝液（pH 7、8，0、05 mol·L-1）製成勻漿液。取組織勻漿液0、2 mL和20% Triton X-1000 4 mL加入到2、5 mL磷酸緩衝液中，再加入司立吉林（單胺氧化酶-B抑製劑）或氯吉林（單胺氧化酶-A抑製劑），溶液混合後37 ℃預孵育15 min，使酶和抑製劑充分反應。再加入30 μL二氫溴脲胺（底物，與單胺氧化酶反應生成4-羥基喹啉）至終濃度22 μmol·L-1，37 ℃下反應30 min，隨後立即加入0、2 mL 5 mol·L-1高氯酸。1 500×g條件下離心15 min，把1 mol·L-1氫氧化鈉2、5 mL加入至0、5 mL上清液中。用熒光光譜儀在激發波長315 nm和發射波長380 nm處，檢測熒光強度。通過標準曲線，確定4-羥基喹啉濃度。采用Bradford法測定蛋白含量[13]。單胺氧化酶活性以nmol·h-1·mg-1表示。
1、9 數據統計采用SPSS 16、0統計軟件包進行統計學處理，數據以±s表示，藥物作用以One-way ANOVA方法分析，組間差異（P-1後，小鼠的熱覺痛閾劑量依賴性地增加，並且40，80 mg·kg-1阿魏酸的差異有統計學意義（P-1）也對CCI小鼠有一定的改善作用（P-1後，小鼠的機械痛閾劑量依賴性地增加，並且40，80 mg·kg-1阿魏酸的差異有統計學意義（P-1）或丙咪嗪（10 mg·kg-1）之後，5-HT和NE含量都呈現不同程度地上升，尤其是40，80 mg·kg-1劑量的阿魏酸和丙咪嗪；5-HT轉換率在此3個腦區中有顯著的下降趨勢（表1～3）。