琥珀酸對原代心肌細胞缺氧複氧損傷的保護作用
藥理
作者：湯喜蘭 劉建勳 李澎 董偉 李磊 鄭詠秋 侯金才
[摘要] 本研究采用SD大鼠乳鼠心肌細胞原代培養，複製心肌細胞缺氧複氧損傷模型，考察琥珀酸對心肌細胞缺氧複氧損傷的LDH漏出率的影響，並進一步采用流式細胞術及Western blot考察琥珀酸對心肌細胞凋亡，cleaved caspase-3及p-Akt的影響，探討琥珀酸對新生大鼠原代心肌細胞缺氧複氧損傷的保護作用。研究結果發現：①琥珀酸31、25～500 mg·L-1對原代心肌細胞活力無明顯影響，琥珀酸400，200，100，50 mg·L-1均可顯著降低心肌細胞缺氧複氧損傷LDH漏出率（P-1可顯著降低缺氧複氧損傷所致的心肌細胞凋亡百分數（P-1可顯著增加心肌細胞的p-Akt蛋白表達（P-1對p-Akt蛋白表達無明顯影響。因此，本研究認為琥珀酸可通過激活Akt的磷酸化而抑製心肌細胞缺氧複氧所致的壞死和凋亡。
[關鍵詞] 琥珀酸；心肌細胞；缺氧複氧；壞死；凋亡
[收稿日期] 2013-04-22
[基金項目] 國家“重大新藥創製”科技重大專項（2012ZX-004-002）；國家自然科學基金項目（，）
[通信作者] *劉建勳，研究員，博士生導師，從事中藥心腦血管藥理學研究，Tel：（010），E-mail： liujx0324@ sina、com
[作者簡介] 湯喜蘭，博士研究生，Tel：（010），E-mail： xilan2013@gmail、com 琥珀酸（succinic acid），別名丁二酸，是一種常見的天然有機酸，可由三羧酸循環途徑代謝產生，廣泛分布在廣棗[1]、仙人掌[2]、軟棗獼猴桃[3]等多種天然植物中，廣泛應用於化工、醫藥、食品等行業。目前，有關琥珀酸對心血管疾病的藥理作用研究較為少見。作者前期[4]研究發現廣棗有機酸部分（主要含檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、酒石酸等小分子有機酸成分）對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有較好的保護作用。本研究旨在探討琥珀酸對心肌細胞缺氧複氧損傷的保護作用及其作用機製。
1 材料
1、1 動物 SD大鼠乳鼠，SPF級，出生1～2 d，雌、雄不限，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號SCXK（京） 2012-0001。
1、2 藥物琥珀酸購自中國食品藥品檢定研究院（批號-）。鹽酸地爾硫卓購自Sigma公司（批號D2521）。
1、3 試劑 DMEM高糖培養基（12100-046，GIBCO）；優級胎牛血清（TBD21HY，天津市瀚洋生物製品科技有限責任公司）；II型膠原酶（17101-015，GIBCO）；胰酶（0458，GIBCO）； 5-溴-2′-脫氧鳥苷（B-5002，Sigma）；LDH試劑盒（，中生北控生物科技股份有限公司）；MTT（298-93-1，Amresco）；DMSO（D-5879，Sigma）；FITC-annexin V/propidium iodide凋亡檢測試劑盒（，BD Biosciences）；cleaved-caspase 3 抗體（C8487，Sigma）；p-Akt（Ser473，4060，Cell Signaling ），Akt （9272，Cell Signaling）；彩色預染蛋白質分子量標準（P0068，碧雲天生物技術研究所）；RIPA裂解緩衝液（P0013C，碧雲天生物技術研究所）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（P0012，碧雲天生物技術研究所）。
1、4 儀器 CO2培養箱（Sanyo MCO175）；倒置顯微鏡（Olympus Sh1）；酶標儀（BioTek SYNERGYTM 4）；半自動生化儀（Screen Master 3000+）；流式細胞儀（Epics Elite， Beckman Coulter）；垂直電泳儀（Bio-Rad）；Chem Doc XRS+凝膠成像儀（Bio-Rad）。
2 方法
2、1 新生大鼠原代心肌細胞培養方法參考文獻進行心肌細胞原代培養[5-7]。無菌條件下取乳鼠心髒，PBS洗心髒，剪碎心室組織，采用含0、062 5 g·L-1胰酶和0、05 g·L-1II型膠原酶的混合消化液進行消化，細胞懸液過200目篩，2 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，用含10%新生牛血清的DMEM培養液重懸細胞，37 ℃，5% CO2差速貼壁1 h。收集未貼壁細胞，以6×105 個/mL分別接種於96孔板（100 μL/孔，用於細胞活力檢測）和直徑35 mm培養皿（2 mL/皿，用於LDH釋放，流式及蛋白表達）。24 h換液，取培養72 h同步搏動的細胞進行實驗。
2、2 琥珀酸對原代心肌細胞活力的影響琥珀酸采用DMSO溶解，實驗分為正常組，0、5% DMSO組，琥珀酸500，250，125，62、5，31、25 mg·L-1組。藥物作用24 h後，棄上清液，PBS洗細胞3次，96孔板每孔加入PBS配製的1 g·L-1 MTT溶液（100 μL/孔）。培養箱內孵育4 h後，棄去MTT液，加入DMSO（100 μL/孔），酶標儀570 nm檢測吸光度A。按照公式計算細胞增殖抑製率（IC）。
IC=（A0、5% DMSO組-A加藥組）/A0、5% DMSO組×100%
2、3 心肌細胞缺氧複氧損傷模型及體外加藥參考文獻複製心肌細胞缺氧複氧損傷模型[5-7]，具體如下：①缺氧：取出35 mm培養皿，棄去培養液，無糖台氏液洗細胞3次，每孔加入預先以95%N2-5%CO2混合氣飽和15 min的無糖台氏液2 mL。將培養皿敞蓋放入自製缺氧盒中，通入95%N2-5%CO2混合氣（流速1 L·min-1），通氣15 min後，夾閉進氣管和出氣管並將缺氧盒置於細胞培養箱內3 h進行缺氧。②複氧：打開缺氧盒，取出培養皿，吸出缺氧液，每皿加入2 mL含2、5%胎牛血清的DMEM液，置培養箱內繼續培養2 h（用於LDH檢測）或6 h（用於流式，cleaved caspase-3，Akt及p-Akt蛋白表達）。