藥物以DMSO溶解，按照1∶1 000的比例加入培養上清液，分別在缺氧開始和複氧開始時各加藥1次。正常組細胞給予含相應DMSO及糖的台氏液，培養3 h後，更換含2、5%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養2 h或6 h。
2、4 LDH釋放實驗分成正常組、模型組、陽性藥地爾硫卓45 mg·L-1組、琥珀酸400，200，100，50 mg·L-1組。複氧結束後，取出各組細胞複氧液，每皿加入2 mL超純水，-70 ℃低溫冰箱凍融1次裂解細胞，取各組細胞裂解液。采用酶反應動力監測法測定各組缺氧液、複氧液、裂解液的LDH含量，按下列公式計算LDH漏出率。
LDH漏出率=（缺氧末上清LDH含量+複氧末上清LDH含量）/（缺氧末上清LDH含量+複氧末上清LDH含量+裂解液中LDH含量）×100%
2、5 流式檢測實驗分成正常組、模型組、琥珀酸400，200 mg·L-1組。細胞複氧結束後，PBS洗細胞2遍，加入0、25%胰酶（500 μL/皿）消化8 min，加入500 μL心肌細胞培養液終止消化，收集細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入1×binding buffer 400 μL重懸細胞至1×106 個/mL，取200 μL細胞溶液（約1×105個細胞）至5 mL EP管，並分別加入5 μL FITC-Annexin V及5 μL PI，混勻，常溫避光15 min，上機分析。
2、6 cleaved caspase-3，Akt，p-Akt蛋白表達實驗分成正常組、模型組、琥珀酸400，200 mg·L-1組。細胞複氧6 h後，棄培養液，PBS洗2遍，加入RIPA（臨用前加入PMSF及磷酸酶抑製劑）裂解液60 μL，冰上裂解30 min，收集細胞，12 000×g，4 ℃離心5 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，95 ℃沸水進行蛋白變性，樣品-80 ℃保存。20 μg蛋白上樣，采用5%濃縮膠和12%分離膠進行恒壓電泳（濃縮膠：50 V；分離膠：100 V），100 V 恒壓轉移75 min（cleaved caspase-3）或95 min（Akt和p-Akt），5% BSA封閉1 h，rabbit anti-cleaved caspase-3（1∶500），rabbit anti-Akt （1∶1 000）and rabbit anti-p-Akt（1∶2 000），mouse anti-α-actin（1∶2 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜9 min×6次，5% BSA封閉30 min，抗兔二抗（1∶4萬，針對目的蛋白）或抗小鼠二抗（1∶4萬，針對α-actin）室溫孵育30 min，TBST洗膜9 min×6次，進行化學發光顯影及Image Lab軟件分析。
2、7 統計方法采用SPSS 18、0統計軟件單因素方差分析（ANOVA）進行統計，數據以±s表示，組間差異采用Student-Newman-Keuls （SNK）進行比較，P-1可以顯著降低心肌細胞缺氧複氧損傷後LDH漏出率（P-1均可以顯著降低心肌細胞
缺氧複氧損傷所致的LDH漏出（P-1均可顯著降低心肌細胞凋亡百分數（P-1凋亡百分數正常-10、57±3、44模型-19、60±1、951）琥珀酸40014、67±2、352）20013、37±3、163）3、4 琥珀酸抑製缺氧複氧誘導的心肌細胞cleaved caspase-3蛋白表達與正常組相比較，心肌細胞缺氧複氧損傷後cleaved caspase-3 蛋白表達顯著增加（P-1均可顯著抑製心肌細胞缺氧複氧所致的cleaved caspase-3蛋白表達增加，與模型組比較，有顯著性差異（P-1可顯著增加心肌細胞缺氧3 h 複氧6 h 損傷所致的p-Akt蛋白表達（P-1對p-Akt蛋白表達未見明顯影響。
4 討論
琥珀酸是中藥琥珀的主要活性成分，也是三羧酸循環的中間代謝物，當前已經成為製藥工業的重要原料，具有重要的開發應用前景。有關琥珀酸的藥理報道並不多見。黃黎等報道表明琥珀酸具有抗炎、鎮靜、解熱鎮痛的作用[8]。琥珀酸可通過增強突觸前γ-氨基丁酸的自發性釋放，對海馬CA1區神經元產生超極化作用，從而抑製癲癇發作[9]。
心肌缺血再灌注損傷是缺血性心髒病常見的病理生理過程，心肌細胞缺氧複氧是心肌缺血再灌注損傷的體外經典模擬，因此，基於琥珀酸可能具有心血管藥理活性，本研究考察了琥珀酸對心肌細胞缺氧複氧損傷的影響，探討琥珀酸對心肌缺血再灌注
琥珀酸對缺氧複氧誘導的心肌細胞Akt，p-Akt蛋白表達的影響
Fig、2 Effect of succinic acid on expressions of Akt and p-Akt in cardiomyocytes subjected to 3 h hypoxia followed by 6 h reoxygenation
損傷的作用機製。研究結果發現琥珀酸可以抑製心肌細胞缺氧複氧損傷所致的LDH漏出，心肌細胞凋亡百分數及cleaved caspase-3的蛋白表達，研究結果提示琥珀酸可以抑製心肌缺血再灌注過程中心肌細胞的凋亡和壞死。
Akt磷酸化可以抑製心肌細胞的壞死和凋亡，保護心肌細胞，對缺血性心髒病的治療具有重要意義[10]。本研究進一步考察了琥珀酸對缺氧複氧損傷所致的心肌細胞Akt磷酸化的影響，結果表明琥珀酸400 mg·L-1可顯著增加心肌細胞缺氧複氧損傷所致的p-Akt蛋白表達。因此，認為琥珀酸可以通過激活Akt的磷酸化，從而保護心肌缺血再灌注過程中心肌細胞的損傷。
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