基於HPLC—Q—TOF/MS的代謝組學方法用於解毒祛瘀滋陰方對係統性紅斑狼瘡幹預作用的研究
藥代動力學
作者：胡金波 穀恒存 丁誌山 姚立 範永升 丁興紅
[摘要] 該文建立了基於高效液相色譜-四級杆-飛行時間質譜聯用（HPLC-Q-TOF/MS）的代謝組學方法，研究係統性紅斑狼瘡（SLE）小鼠經解毒祛瘀滋陰方治療後血清代謝物的變化，探討SLE發病及藥物作用機製。利用正交偏最小二乘法（orthogonal partial least squares， OPLS）對實驗數據進行模式識別，發現對照組、SLE模型組、解毒祛瘀滋陰方治療組和醋酸潑尼鬆治療組的代謝圖譜存在較明顯的差異。根據OPLS載荷圖，利用精確質量數結合二級質譜鑒定出traumatic acid，PAF，12（S）-HETE，15（S）-HETrE，Hepoxilin B3等12種差異代謝物。SLE小鼠經解毒祛瘀滋陰方治療後，有效調節PAF，12（S）-HETE等差異代謝物的相對含量接近於對照組水平。代謝通路分析表明，SLE發病會導致體內不飽和脂肪酸和氨基酸代謝通路顯著變化，而解毒祛瘀滋陰方對SLE紊亂的不飽和脂肪酸代謝通路具有一定修複調節作用。
[關鍵詞] 代謝組學；係統性紅斑狼瘡；解毒祛瘀滋陰方；HPLC-Q-TOF/MS；OPLS
[稿件編號] 2013-03-21
[基金項目] 國家自然科學基金項目（）；高等學校博士學科點專項科研基金項目（001）
[通信作者] *丁興紅，博士，副教授，碩士生導師，E-mail： zmkm1978@126、com 係統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是以自身抗原抗體生成和臨床多器官受累為特點的複雜自身免疫性疾病[1-2]。SLE發病累積多個係統，目前尚無有效根治方法，嚴重影響患者的生活質量。解毒祛瘀滋陰方以生地黃清熱涼血為君，白花蛇舌草、升麻清熱解毒消斑為臣，製鱉甲補陰益腎退熱，赤芍、積雪草活血散血俱為佐藥，青蒿退熱，芳香體輕，炒薏苡仁功善利濕健脾，佛手片舒筋除痹，生甘草調和諸藥為使。諸藥合用，通過多靶點、多通路的作用路徑對SLE有著較好的臨床治療效果[3]，患者依從性好。解毒祛瘀滋陰方成分複雜，作用靶點多向，一般性生化指標難以整體的評估其治療作用。代謝組學作為係統生物學的研究方法之一，其整體宏觀的研究思路有助於揭示中醫藥複雜作用機製[4-5]。液相色譜-飛行時間-質譜聯用（LC-Q-TOF/MS）技術具有靈敏度好和分辨率高等特點，是代謝組學研究的有力工具[6]。本實驗擬采用HPLC-Q-TOF/MS建立代謝組學的分析方法，以原發性SLE小鼠MRL/lpr作為動物模型，研究SLE發病時機體代謝通路的改變，及解毒祛瘀滋陰方幹預後對SLE代謝通路的調節作用。
1 材料和方法
1、1 試劑和儀器甲酸（分析純，阿拉丁公司），甲醇（色譜級，美國Tedia公司），醋酸潑尼鬆片（天津力生製藥股份有限公司），乙腈（色譜級，美國Tedia公司），質譜參比液和校準液為美國安捷倫公司所提供。
1260 infinity高效液相色譜儀，Eclipse Plus C18色譜柱（2、1 mm×50 mm，1、8 μm）， Agilent 6520 Q-TOF/MS質譜係統，均購自美國安捷倫公司；Centrifuge 5417R高速冷凍離心機（德國，Eppendorf公司）；Mass Hunter軟件（美國，Agilent Technologies公司），Milli-Q Biocel純水儀（美國，Millipore公司）；Mass Profiler Professional（MPP）軟件（美國，Agilent Technologies公司）。
1、2 動物實驗和樣品收集使用8周齡的MRL/lpr小鼠30隻隨機分為醋酸潑尼鬆治療組、解毒祛瘀滋陰方治療組和SLE模型組，10隻8周齡的C57BL/6J小鼠作為對照組，實驗動物均購於浙江中醫藥大學動物實驗中心。實驗動物飲水飲食自由，由浙江中醫藥大學動物實驗中心SPF級飼養。實驗小鼠適應性喂養1周後，開始灌胃給藥。醋酸潑尼鬆治療組小鼠灌胃醋酸潑尼鬆片溶液，即將醋酸潑尼鬆片用生理鹽水溶解配製成0、4 g·L-1醋酸潑尼鬆溶液用於灌胃，灌胃劑量為18 mL·kg-1；解毒祛瘀滋陰方治療組灌胃18 mL·kg-1的解毒祛瘀滋陰方；模型組和空白組使用等劑量的生理鹽水灌胃。小鼠給藥10周後，采用腹腔靜脈取血，全血靜置30 min後，采用3 000 r·min-1， 10 min，4 ℃離心，取血清-80 ℃保存備用。