1、3 血清樣品分析在室溫下解凍血清樣品，取100 μL置於離心管中，加入400 μL甲醇沉澱蛋白，渦旋30 s，在靜置10 min後，采用13 000 r·min-1， 10 min，4 ℃低溫高速離心，取300 μL上清液用去離子水1∶1稀釋，稀釋後的600 μL血清樣品用0、22 μm尼龍膜過濾，棄去初始濾液，用於液相質譜分析。從4個實驗組樣本中抽取等量的血清混合，製成質量控製品，質量控製品的前處理方法與樣品相同。
色譜條件：流動相A為0、1%甲酸水溶液，B為0、1%甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脫（0～2 min，20%B；2～12 min，20%～65%B；12～24 min，65%～85%B；24～26 min，85%～98%B；26～28 min，98%B），後運行時間為5 min。設置柱溫箱溫度為35 ℃，自動進樣器溫度為5 ℃。
質譜條件：分別使用ESI正、負離子模式采集數據。掃描範圍m/z 50～1 000，幹燥氣為N2，幹燥氣溫度為350 ℃，正、負離子模式毛細管電壓分別為4 000， 3 500 V，碎裂電壓為180 V，錐孔電壓為60 V，霧化器壓力為275、8 kPa。使用Centroid模式保存質譜數據，數據采集速率為2 spectrum·s-1。數據采集過程中參比液實時監測校準質譜係統。二級質譜數據采集時，碰撞能分別設置為20 eV，二級質譜采集速率為2 spectrum·s-1。
1、4 數據處理使用Mass Hunter Workstation（version B、03、01 Qualitative Analysis， Agilent）提取代謝物信息，利用分子特征提取（molecular feature extraction， MFE）算法提取總離子流圖（total ion current，TIC）中特征離子。提取離子豐度閾值為200，基峰豐度閾值為1 000，正、負離子模式加和離子種類分別為[M+H]+和[M-H]-，提取單電荷離子。提取後代謝物信息包括保留時間，精確質量數和豐度，將提取後的數據轉存為、CEF格式文件，利用MPP軟件進行數據預處理。使用保留時間和精確質量數對離子峰進行對齊，數據對齊時保留時間偏差設置為0、15 min，質量數偏差為10，然後對離子響應值進行歸一化處理，利用歸一化後的離子豐度中位數進行數據的中心化，再篩選在每組80%樣本中能被檢測的離子建立代謝物數據矩陣。合並正負離子模式下所采集的代謝物離子，利用SIMCA-P中OPLS進行數據分型，並根據載荷圖得到潛在的差異代謝物。差異代謝物使用精確的質量數和二級質譜圖，利用METLIN[7] （http：//metlin、scripps、edu/），KEGG（http：//www、genome、jp/kegg/），Massbank （http：//www、massbank、jp/index、 html）和HMDB （http：//www、hmdb、ca/）等數據庫鑒定代謝標記物，分析代謝通路。
2 結果與討論