LC—MS/MS測定大鼠血漿中咖啡酸、綠原酸及其藥代動力學研究
藥代動力學
作者：戴國梁 馬世堂 劉史佳 程小桂 臧雨馨 居文政 談恒山
[摘要] 該研究建立大鼠血漿中咖啡酸、綠原酸的LC-MS/MS測定方法，並用於大鼠體內的藥代動力學研究。6隻SD大鼠，單劑量靜脈注射（4 mL·kg-1）燈盞細辛注射液，以替硝唑為內標，用LC-MS/MS測定給藥後血漿中的藥物濃度，並用DAS 1、0軟件計算藥動學參數。咖啡酸、綠原酸的線性範圍分別為2～128 μg·L-1（r = 0、998 1），3～384 μg·L-1（r = 0、998 7）。方法學考察均符合要求。日內、日間變異係數（RSD）均小於10%，精密度和準確度等均符合生物樣品分析的要求。大鼠體中咖啡酸藥代動力學參數：t1/2β為（130、91±38、77） min，AUC0-t為（4、89±0、96） mg·min·L-1，CL為（0、12±0、02） L·min-1·kg-1；綠原酸藥代動力學參數：t1/2β為（49、38±8、85） min，AUC0-t為（9、54±0、95） mg·min·L-1，CL為（0、09±0、003） L·min-1·kg-1。該研究建立的LC-MS/MS分析方法準確靈敏，適於咖啡酸、綠原酸的藥代動力學研究。
[關鍵詞] 燈盞細辛注射液；綠原酸；咖啡酸；大鼠；藥代動力學；LC-MS/MS
[稿件編號] 2013-03-13
[基金項目] 國家“重大新藥創製”科技重大專項（2012ZX-002）；江蘇省中醫藥領軍人才項目（LJ）；江蘇高校優勢學科建設工程項目（2010）
[通信作者] *居文政，Tel：（025）-60310，E-mail：wzhju333@163、com 燈盞細辛注射液為燈盞細辛的幹燥全草經提取製成的中藥注射液，收載於2010年版《中國藥典》一部[1]，具有活血化瘀，通絡止痛的功效，是目前臨床上使用較為廣泛的治療心腦血管疾病的傳統中藥之一。以往研究表明燈盞細辛的有效成分主要為黃酮類成分——燈盞乙素。通過深入研究，發現酚酸類成分也具有擴張血管和抑製血栓形成的藥理活性[2]。中藥酚酸類成分包括咖啡酸、綠原酸等，因其顯著的抗炎、抗氧化、抗凝血等多種生物活性而被國內外廣泛研究[3-5]。
在燈盞細辛注射液中，已證實黃酮類與酚酸類協同發揮藥效作用[6-7]，而燈盞乙素在體內代謝過程已有較多文獻報道[8-10]，對酚酸類成分的體內代謝過程研究卻比較少。因此深入研究酚酸類成分對明確燈盞細辛注射液的藥動藥效至關重要。本文旨在建立高效、靈敏的LC-MS/MS用於測定大鼠尾靜脈注射燈盞細辛注射液後綠原酸和咖啡酸的血藥濃度，並用於燈盞細辛注射液在大鼠體內的藥代動力學研究。
1 材料
1、1 試藥燈盞細辛注射液（雲南生物穀燈盞花藥業有限公司，批號，規格10 mL/支）；對照品咖啡酸（批號-）、綠原酸（批號-）和替硝唑（批號-）均購於中國食品藥品檢定研究院。水為超純水，甲酸、甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。
1、2 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀；API 4000 LC-MS/MS三重四級杆質譜儀，配有電噴霧化離子源（ESI），色譜工作站：Analyst 1、4、2；AE240電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；MICRO-17R冷凍離心機（美國Thermo公司）；WH-2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；Drict-Q5超純水機（法國Millipore公司）。
1、3 動物 SD大鼠，雌雄各半，6隻，體重250～270 g，由南京中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（浙）2008-0033。
2 方法
2、1 色譜及質譜檢測條件 Agilent ZOBAX SB C18色譜柱（4、6 mm×150 mm， 5 μm）；流動相為甲醇-2 mmol·L-1醋酸銨水溶液（60∶40）；流速為500 μL·min-1；柱溫30 ℃。離子源ESI；離子化模式負離子；定量模式為多反應檢測模式（MRM）；離子源電壓4 000 V；離子源溫度400 ℃；綠原酸的DP，EP，CE，CXP-56 ，-11，-30，-4 V；咖啡酸的DP，EP，CE及CXP分別為-50，-10，-25，-5 V；替硝唑的DP，EP，CE，CXP分別為-25，-10，-15，-8 V；檢測對象綠原酸m/z 353、1/191、0；咖啡酸m/z 178、9/134、9；替硝唑m/z 246、0/125、8。
2、2 對照品溶液的配製精密稱取適量綠原酸對照品，用甲醇配製成3、84 mg·L-1的儲備液；精密吸取適量，用甲醇分別稀釋成3 840，1 920，960，480，240，120，30 μg·L-1的係列標準溶液。精密稱取適量咖啡酸對照品，用甲醇配製成1、28 mg·L-1的儲備液；精密吸取適量，用甲醇分別稀釋成1 280，640，320，160，80，40，20 μg·L-1的係列標準溶液。以上溶液於4 ℃保存，備用。
2、3 內標物溶液的配製精密稱取適量替硝唑對照品，用甲醇溶解並稀釋成1、2 mg·L-1，於4 ℃保存，備用。
2、4 血漿樣品處理取血漿樣品100 μL，加入1、2 mg·L-1替硝唑溶液（內標）20 μL，1 mol·L-1鹽酸溶液50 μL，渦旋30 s，再加入乙酸乙酯800 μL，渦旋振搖3 min，12 000 r·min-1離心5 min。取上清液750 μL，40 ℃氮氣流吹幹，加100 μL 50%甲醇複溶，12 000 r·min-1離心5 min，取上清液5 μL進樣分析。
2、5 給藥劑量的確定燈盞細辛注射液靜脈注射臨床給藥劑量為20～40 mL·d-1，每日1～2次，人的平均體重按60 kg計算，則其臨床給藥劑量為0、33～1、33 mL·kg-1。按大鼠每千克體重的臨床等效量是人的6倍計算，則燈盞細辛注射液大鼠尾靜脈注射給藥劑量為1、98～7、98 mL·kg-1，經預實驗，確定大鼠給藥劑量為4 mL·kg-1。經測定，該注射液中綠原酸質量濃度為170、3 mg·L-1，咖啡酸質量濃度為135、1 mg·L-1
2、6 藥代動力學研究 SD大鼠6隻，給藥前12 h禁食不禁水，分別尾靜脈注射燈盞細辛注射液4 mL·kg-1。於給藥前及給藥後5，10，20，30，45 min，1，1、5，2，3，4，6，8，10，12 h經眼眶後靜脈叢取血約0、3 mL，置於肝素化試管中，以4 000 r·min-1離心10 min，取上層血漿於-40 ℃保存待測。
2、7 數據處理大鼠靜脈給藥後測得的血藥濃度（C）-時間（t）數據應用DAS 1、0軟件進行處理。選擇適宜的數學模型擬合，計算藥代動力學參數。
3 結果
3、1 專屬性實驗在本實驗所采用的LC-MS/MS條件下，咖啡酸、綠原酸和替硝唑的保留時間分別為2、6，2、5，3、4 min。咖啡酸、綠原酸和內標互不幹擾，峰形良好，無雜峰幹擾，基線平穩。
3、2 標準曲線製備取空白血漿100 μL，分別加入綠原酸、咖啡酸對照品係列標準溶液各10 μL，配製成相當於綠原酸及咖啡酸血漿質量濃度分別為3，12，24，48，96，192，384 μg·L-1和2，4，8，16，32，64，128 μg·L-1的血漿樣品。按2、4項下操作，取5 μL進樣分析。以各成分峰麵積與內標峰麵積的比值Y對血漿質量濃度X進行線性回歸運算，求得的回歸方程即為標準曲線。綠原酸回歸方程：Y=0、435 7X-0、010 7（r = 0、998 7），定量下限為3 μg·L-1。咖啡酸回歸方程Y=1、109 8X-0、058 7（r = 0、998 1），定量下限為2 μg·L-1。