3、3 準確度和精密度取空白血漿100 μL，按上述2、4項下製備綠原酸和咖啡酸低、中、高3個質量濃度（綠原酸血漿質量濃度為3，48，192 μg·L-1；咖啡酸血漿質量濃度為2，16，64 μg·L-1）的質量控製（QC）樣品，每個濃度平行做5份，連續測定3 d。根據隨行標準曲線求得實測濃度。實測濃度的RSD即為精密度，實測濃度和加入濃度的比值即為準確度。結果表明，綠原酸日內、日間準確度分別為97、7%～101、3%（RSD≤8、5%，n=5）和96、1%～103、8%（RSD≤9、4%，n=15）；咖啡酸日內、日間準確度分別為92、3%～106、7%（RSD≤8、8%，n=5）和98、2%～108、1%（RSD≤9、8%，n=15），實驗結果符合生物樣品分析方法的要求。
3、4 提取回收率取空白血漿100 μL，配製3、3項下低、中、高3個不同濃度含藥血漿質控樣品，按上述2、4項下操作後進樣分析，以血漿中綠原酸、咖啡酸的峰麵積與相應質量濃度對照品溶液中綠原酸、咖啡酸峰麵積的比值計算出上述3種質量濃度的提取回收率，每個濃度平行做5份。經LC-MS/MS測定後，低、中、稿3種濃度下的提取回收率分別為綠原酸（84、3±5、5）%，（89、1±3、3）%，（92、4±6、3）%；咖啡酸（82、1±1、9）%，（85、2±6、0）%，（88、2±4、6）%。采用同樣的方法考察了內標的提取回收率為（90、1±2、4）%。
A、空白血漿樣品；B、混合對照品；C、血漿樣品；1、咖啡酸；2、綠原酸；3、替硝唑。
圖1 樣品的液-質聯用離子流圖
Fig、1 Combined LC-MS/MS ion chromatograms of samples
3、5 穩定性考察取空白血漿100 μL，配製3、3項下低、中、高3個不同濃度含藥血漿質控樣品，按上述2、4項下操作方法處理樣品。考察含藥血漿樣品處理好後溶液中分析物在室溫放置24 h、含藥血漿樣品-20 ℃反複凍融3次、含藥血漿樣品-40 ℃長期冷凍28 d的穩定性，每個濃度平行3份。結果表明，經處理後的血漿樣品室溫放置24 h後綠原酸及咖啡酸血藥濃度的RSD均小於9、82%，-40 ℃保存28 d血藥濃度的RSD 均小於8、65%，經過3個凍融周期後2個分析物的血藥濃度RSD均小於9、57%。
3、6 介質效應考察取離心管數隻，分別精密加入低、中、高的3個濃度綠原酸對照品溶液（30，480，1 920 μg·L-1）及咖啡酸對照品溶液（20，160，640 μg·L-1）各10 μL，再分別加入內標替硝唑溶液20 μL，水60 μL，旋渦1 min，於12 000 r·min-1離心5 min，進行LC-MS/MS分析，進樣量5 μL，記錄峰麵積A1。除不加內標外，另按“血漿樣品處理”項下操作提取空白血漿數管，揮幹後同上操作，記錄峰麵積A2。A1和A2的比值（A2/A1×100%）即為介質效應ME（%）。綠原酸及咖啡酸血漿樣品低、中、高3種濃度LC-MS/MS介質效應（n=3）分別為83、14%，86、32%，83、90%和86、79%，92、15%，88、24%，內標替硝唑介質效應（n=9）為82、53%。
3、7 大鼠體內藥代動力學大鼠單劑量（4 mL·kg-1）尾靜脈注射燈盞細辛注射液後綠原酸和咖啡酸的血藥濃度-時間曲線。所測數據使用DAS 1、0軟件進行處理，主要藥動學參數。由分析結果可知，綠原酸和咖啡酸在大鼠體內的藥動學符合二室開放模型。
大鼠體內綠原酸和咖啡酸的平均血藥濃度-時間曲線（n=6）
Fig、2 Mean plasma concentration-time curves for chlorogenic acid and caffeic acid in rat plasma（n=6）
4 討論
目前文獻報道的中藥複方製劑中綠原酸和咖啡酸的血藥濃度測定方法大多為HPLC[11-13]，且目前燈盞細辛注射液在大鼠體內的藥代動力學研究主要測定燈盞乙素和總咖啡酸酯[14-15]，對於注射液中單
個酚酸化合物的藥代動力學研究較少。
本實驗采用LC-MS/MS測定血漿中綠原酸和咖啡酸的濃度，提高了靈敏度。另外，本文對血樣中酚酸類成分的提取方法進行了考察：甲醇沉澱、乙腈沉澱、乙酸乙酯提取、乙酸乙酯/乙醚（3∶1）提取，每個提取或沉澱條件考察了不同的酸化條件（加10，20，30，50，100 μL不同量的1 mol·L-1鹽酸），結果發現50 μL 1mol·L-1鹽酸酸化後乙酸乙酯的提取回收率高，無內源性物質幹擾，重現性好。
蘇美英等[16]靜脈給予大鼠咖啡酸單體50 mg·kg-1後，咖啡酸單體在大鼠體內的半衰期（t1/2）為（0、45±0、05） h，體內駐留時間（MRT）為（0、24±0、06） h。本實驗中大鼠給予燈盞細辛注射液的劑量為4 mL·kg-1，若以咖啡酸含量計，咖啡酸的靜脈給藥劑量為540、4 μg·kg-1，而此時咖啡酸在大鼠體內的t1/2為（130、91±38、77） min，MRT為（198、74±18、45） min。本實驗中咖啡酸的給藥劑量遠低於50 mg·kg-1，但是注射液中咖啡酸在大鼠體內的t1/2和MRT卻明顯高於單獨給予咖啡酸單體。由此推測，燈盞細辛注射液中的某些成分與咖啡酸發生相互作用，延長了咖啡酸在大鼠體內的時間，但發生該現象的原因還不清楚，有待進一步研究。
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