腦微透析與自動采血技術聯用研究丹參素的藥動學特性
藥代動力學
作者：吉戀英 楊誌宏 候叢頌 孫曉波
[摘要] 通過微透析法聯合自動采血技術研究丹參素在大鼠體內的藥動學特性。微透析探針植入大鼠側腦室，連續收集靜脈注射丹參素後的透析液樣品及血液樣品，采用LC-MS/MS測定丹參素濃度，經回收率校正後，用WinNonlin藥動學軟件計算主要藥動學參數。靜脈注射丹參素後，丹參素在血液中、腦內的Ke分別為0、04，0、018 min-1，t1/2為16、64，58、76 min，AUC0-t為812、59，51、19 min·mg·L-1，MRT為15、28，79、97 min。建立的LC-MS/MS方法簡便、高效、無幹擾，可進行丹參素生物樣品的檢測；微透析技術與自動采血技術聯用，較好的反映了丹參素在血液及大腦中的動力學特征，為藥物藥動學研究提供一個新視角。
[關鍵詞] 丹參素；腦微透析；自動采血；藥動學；LC-MS/MS
[收稿日期] 2013-04-03
[基金項目] 國家自然科學基金項目（，）；國家“重大新藥創製”科技重大專項（2013ZX-022）；高等學校博士學科點專項科研基金項目（049）；國家科技支撐計劃項目（2008BAI51BOO）
[通信作者] *楊誌宏，副研究員，主要從事藥物代謝動力學及中藥複方配伍機製研究，Tel：（010），E-mail：zhyang@implad、ac、cn；*孫曉波，研究員，博士生導師，從事中藥藥效物質基礎與作用機製研究、創新藥物開發研究，Tel：（010），E-mail：sxbimplad@gmail、com
[作者簡介] 吉戀英，碩士研究生，，E-mail：jilianying101@gmail、com 丹參Salvia miltiorrhiza Bunge為唇形科鼠尾草屬植物丹參的幹燥根及根莖，現代研究表明丹參具有擴張冠脈、增加冠脈血流量、改善腦缺血再灌注損傷、防止心肌缺血和心肌梗死、改善微循環等作用[1-4]，臨床上用於治療中風、冠心病、高血脂症等。丹參素（Danshensu，DSS）是丹參主要的水溶性活性成分之一 [5-6]。丹參素在大鼠血漿、腦內的藥動學行為研究已有報道[7-8]，而同時研究血漿、腦內的丹參素藥動學特性的較少。以往腦內藥代動力學的研究主要采用全腦勻漿測定法研究藥物腦內動力學行為，該法存在實驗動物需要量大、實驗次數多、樣品處理過程複雜、樣品檢測幹擾多等局限性。微透析技術（microdialysis，MD）是近年來興起的一種在線監測活體采樣技術，具有實時、高效、在線、活體的優勢[9-10]，在藥動學研究[11]、藥物轉運[12]、藥物靶向分布[13]等領域中應用廣泛。本研究采用微透析法聯合自動采血技術通過LC-MS/MS分析方法測定大鼠靜脈給予丹參素後不同時間點的血藥濃度，進而研究丹參素在大鼠體內的藥動學特征。
1 材料
1、1 藥品與試劑丹參素鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號-，純度>99%）；對羥基苯甲酸為內標（國藥集團化學試劑有限公司，批號T，純度>99%）。乙腈、甲酸（德國Merck公司）、甲醇（美國Fisher Scientific公司）、乙酸乙酯（美國Honeywell公司），均為色譜純，實驗用水為超純水（電導率為18、2 MΩ·cm2），其他化學試劑均為分析純。人工腦脊液（aCSF）：NaCl 147 mmol·L-1，KCl 2、7 mmol·L-1，CaCl2 1、2 mmol·L-1，MgCl2 0、85 mmol·L-1， pH 7、2～7、4。
1、2 動物健康雄性SD大鼠，SPF級，體重280～300 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號 SCXK（京）2012-0001。
1、3 儀器 Agilent 1200液相色譜儀（美國Agilent公司）；3200QTrap串聯四級杆線性離子阱質譜儀（美國AB SCIEX公司），Turbo Ionspray離子源，Analyst 1、4、2數據處理係統； Milli-Q Gradient A10超純水器（美國Millipore公司）；腦立體定位儀（美國Stoeling公司）；微透析係統（瑞典CMA公司）；MAB6、14、4（瑞典MAB公司）；ABS2自動采血儀（美國Instech Laboratories）。
2 方法和結果
2、1 測定條件色譜條件：Agilent Eclipse Plus-C18色譜柱（2、1 mm×50 mm，3、5 μm），流動相A為0、03%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，采用梯度洗脫方式0～0、2 min，5%～90% B；0、2～3、0 min，90% B，進樣量為20 μL。
質譜條件為電噴霧離子化（ESI）；檢測方式負離子檢測；掃描方式多反應監測（MRM）；離子噴射電壓-4 500 V，溫度450 ℃；用於定量分析的離子反應分別為丹參素m/z 197、2/135、1，內標對羥基苯甲酸m/z 137、0/ 93、0。
2、2 溶液的配製精密稱取丹參素鈉對照品1 mg，用甲醇定容至1 mL，配製成1 g·L-1溶液作為對照品貯備液（於4 ℃下避光保存）。使用aCSF進行倍比稀釋的質量濃度分別是3、20，1、60，0、80，0、40，0、20，0、10，0、05，0、025，0、012 5 mg·L-1的丹參素鈉標準溶液；精密量取適量的丹參素貯備液，用甲醇稀釋成300，200，100，50，25，12、5， 6、25，3、13，1、56，0、78，0、39，0、195，0、 10 mg·L-1的標準溶液。
2、3 樣品處理血樣：取空白血漿100 μL於潔淨玻璃管中，精密加入0、5 mg·L-1內標10 μL，然後加入10% HCl 100 μL，渦旋混勻，加入4 mL的乙酸乙酯振蕩提取5 min，離心並移取全部上清、真空旋蒸，0、03 %甲酸和乙腈混合液100 μL複溶，渦旋振蕩5 min，13 000 r·min-1離心10 min，吸取上清進樣，樣品與內標峰麵積比進行定量分析。
腦微透析液：收集的微透析樣品20 μL，或精密取aCSF稀釋的標準溶液20 μL，加入0、05 mg·L-1內標40 μL。
2、4 標準曲線及最低定量限用權重（ω=1/x2）最小二乘法進行回歸運算，得回歸方程及相關係數：Y= 0、258C-0、005，R2=0、995（aCSF）；Y = 0、419C + 0、006，R2 = 0、999（血漿），丹參素在所檢測的範圍內線性良好。aCSF中丹參素的LLOQ為0、025 mg·L-1，血漿中丹參素的LLOQ為0、01 mg·L-1。
2、5 專屬性血漿中及aCSF中的丹參素色譜圖形良好，內源性物質對丹參素及內標的測定無幹擾，2。丹參素及內標的保留時間分別為1、27，2、86 min。
丹參素（A）和內標（B）質譜圖
Fig、1 The mass spectrum of Danshensu （A） and IS （B）
A、空白aCSF、空白血漿；B、空白aCSF、空白血漿中分別加入0、025，0、01 mg·L-1丹參素及0、05，0、5 mg·L-1內標；C、給藥30 min後腦內及血漿中的丹參素。
丹參素與內標MRM圖
Fig、2 The MRM chromatograms of DSS and IS
2、6 精密度、準確度考察方法見2、2項，使100 μL空白血漿中丹參素的質量濃度為20、0，2、50，0、31，0、02 mg·L-1；aCSF中丹參素的高中低質量濃度分別為1、60，0、40，0、05 mg·L-1，考察批內變異和批間變異情況。精密度、準確度分別使用RSD，RE來表示，見表1。
2、7 穩定性血樣：100 μL空白血漿精密加入不同量的對照品，使丹參素的質量濃度為2、50，0、31，0、02 mg·L-1，置-80 ℃冰箱保存7 d，用37 ℃恒溫水浴解凍後，測定藥物濃度。結果顯示，各濃度丹參素的峰麵積RSD分別為5、0%，5、0%，19%，說明血漿中的丹參素在-80 ℃放置內較穩定。