醒腦靜口服製劑中冰片在腦缺血及假手術大鼠腦組織和血漿中藥物動力學研究
藥代動力學
作者：徐攀 杜守穎 黎迎 陸洋 白潔 郭青麗
[摘要] 為了研究醒腦靜中冰片在腦中風病理狀態腦和血中的藥動學特征，並評價腦中風對冰片透過血腦屏障能力的影響。該實驗采用大腦中動脈線栓再灌注法建立並選取腦中風模型大鼠，並設立假手術組，灌胃給予醒腦靜混懸液，不同時間點采血後進行GC測定，以Kinetica 軟件擬合，計算相關藥動學參數。結果表明在腦中風狀態下的腦、血的Cmax為（1、82±0、825），（1、35±0、43） mg·L-1，AUC0-t為（123、39±55、82），（87、91±39、81） mg·L-1·min，Te （腦/血藥物比）（71、3±3、24）%，大於假手術組的各個參數。從結果中可以看出腦中風的發生能夠促進醒腦靜中冰片透過血腦屏障，增加冰片的入腦量，為冰片的合理使用以及醒腦靜口服製劑的研究提供了參考。
[關鍵詞] 冰片；醒腦靜；腦組織；藥代動力學
[收稿日期] 2013-05-28
[基金項目] 國家自然科學基金麵上項目（）；北京中醫藥大學複方中藥製藥研究創新團隊項目（2011-CXTD-13）；北京中醫藥大學自主課題項目（2011-JYBZZ-JS048）
[通信作者] *杜守穎，Tel：（010），E-mail：dushouying@263、net；*陸洋，E-mail： landocean28@163、com
[作者簡介] 徐攀，碩士研究生，，E-mail：clamslowly@163、com 中風由於它的高發病率和高致殘率，已經成為21世紀威脅人類健康的一大殺手。其中85%的腦中風是由缺血引起的[1]。醒腦靜來源於經典名方——安宮牛黃丸，藥理研究[2-3]表明它有顯著的抗腦缺血再灌注損傷、抗氧化損傷、興奮中樞、解熱、抗炎等藥效，並作為注射劑廣泛應用於腦中風的防治中。但由於注射劑使用不便及安全性問題[4]，近年來關於醒腦靜口服製劑的研究得到重視[5]。冰片是醒腦靜的有效成分之一，並作為“開竅藥”有上行之效，對它的研究多集中在對其他藥物的影響上[6-7]，針對冰片藥物代謝動力學的研究較少。由於藥物的最終使用人是患者，當腦中風發作時，機體的病理變化及各種並發症的發生會對冰片的代謝產生影響。本實驗建立腦缺血模型，研究冰片在病理狀態腦藥動力學和血藥動力學的特征，並設置假手術組進行對比，評價腦中風對冰片透過血腦屏障能力的影響，為臨床用藥方案的確定提供依據。
1 材料
天美D7980氣相色譜儀；氫火焰離子檢測器（FID）檢測器；天美氣相工作站（中國上海天美科學儀器有限公司）；XW-80A 渦旋混合器（上海醫科大學儀器廠）；Anke-TGL-16C高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；IKA-T10BS25勻漿機（德國）； 2634-100栓線（北京沙東生物技術有限公司）。
冰片對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號-）；十八烷（色譜純，天津市光複精細化工研究所）；乙酸乙酯（色譜純，北京化工廠）；醒腦靜口服製劑（實驗室自製，梔子提取物-冰片-麝香酮-鬱金揮發油 38∶18∶3∶1）。
雄性SD大鼠150隻，體重240～260 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK （京）2013-0001。實驗前至少飼養7 d以適應環境。
2 方法
2、1 色譜條件
TM-1701高效毛細管色譜柱（0、25 μm×0、32 mm，30 m）；氫火焰離子檢測器（FID）；氫氣流量 30 mL·min-1；柱溫設置為程序升溫，105 ℃保持 8 min，以50 ℃·min-1升至 185 ℃並保持6 min，然後升至 250 ℃（50 ℃·min-1）保持4 min；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度300 ℃；氮氣流速28 mL·min-1；分流比1∶1；進樣量1 μL。
2、2 溶液及灌胃液的配製
標準溶液與內標溶液的配製：精密稱定冰片對照品及十八烷適量，置於50 mL量瓶中，用乙酸乙酯溶解並稀釋至刻度，分別配製成812、00，60、00 mg·L-1的標準溶液，並將冰片溶液依次逐級稀釋，得係列標準溶液，於4 ℃冰箱中保存備用。
灌胃液的配製：粉碎醒腦靜口服製劑成細粉，稱取適量並溶解於0、7%CMC-Na 溶液中，使冰片含量為16、2 mg·L-1，充分攪拌混勻即得醒腦靜灌胃液。
2、3 缺血性腦中風模型製備
模型參照Zea Longa[8]的方法並進行了改進，大鼠手術前禁食12 h，以20%的烏拉坦腹腔麻醉，頸正中切口，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，結紮頸總動脈近心端和頸外動脈，在頸總動脈結紮的遠心端距離頸總動脈分叉處剪一小口，將栓線由切口插入並沿頸內動脈進線至微遇阻力，插入深度以頸總動脈分叉處開始計算約為（18、0±1、0） mm，結紮頸內動脈，縫合皮膚。2 h後拔線實現大腦中動脈再灌注，於再灌24 h後給藥。假手術組手術與缺血動物相同，但頸內動脈內不插栓線。
2、4 給藥與取樣
腦中風模型及假手術大鼠各55隻，隨機分組，每個采血時間點5隻。給藥前禁食 12 h，自由飲水。在大鼠術後24 h單劑量灌服醒腦靜灌胃液 10 mL·kg-1（按冰片計算為162、0 mg·kg-1），並於給藥後5，10，20，30，45 min，1，1、5，2，4，6 h摘眼球取血0、5 mL，置於肝素化Ep管中，7 000 r·min-1離心10 min，分離血漿，處死大鼠，取出腦組織，生理鹽水洗去殘血，將血漿與腦組織於-20 ℃保存備用。
2、5 樣品的處理
2、5、1 腦組織樣品的處理取單個腦組織，吸幹水分，精密稱重，以腦重（g）-生理鹽水體積（mL）1∶1、5加入的生理鹽水，勻漿。取勻漿液180 μL，加入20 μL 內標溶液，渦旋振蕩1 min，再加入200 μL 乙酸乙酯，渦旋振蕩3 min，1萬 r·min-1下離心10 min，取上清液1 μL進樣檢測。
2、5、2 血漿樣品的處理每份樣品吸取大鼠血漿180 μL，用微量進樣器加入20 μL內標，渦漩混合器振蕩1 min，加入200 μL乙酸乙酯，渦旋振蕩3 min，1萬 r·min-1高速離心10 min，取上清液1 μL 進樣檢測。
2、6 腦組織測定方法學驗證
2、6、1 專屬性考察在上述色譜條件下，測得的空白腦勻漿、加藥腦勻漿和給藥後腦勻漿樣品的GC圖，腦組織中物質不幹擾冰片和內標的測定。
A、空白血漿；B、空白腦勻漿中加冰片對照品（5、64 mg·L-1）；C、大鼠腦勻漿漿樣品；1、冰片；2、十八烷。
圖1 腦組織中冰片氣相色譜圖
Fig、1 Chromatograms obtained from borneol in rats brain
2、6、2 標準曲線取20 μL不同濃度的冰片係列標準溶液，加入到大鼠空白腦勻漿180 μL中，使腦漿中冰片的質量濃度分別為0、056，0、11，0、56，1、13，2、26，5、64，11、28，18、4 mg·L-1，其餘按照2、5、1項下方法處理並進樣分析。以冰片與十八烷峰麵積比值Y對冰片質量濃度X進行線性回歸，回歸方程為Y=0、146 6X + 0、019，r=0、995 9。線性關係在0、018 8～18、04 mg·L-1良好，最低定量限為0、018 8 mg·L-1。
2、6、3 精密度實驗取冰片對照品溶液置於180 μg空白腦漿中，配製成含低、中、高（0、563 9，5、639，11、28 mg·L-1）質量濃度的腦勻漿樣品，按2、5、1項下方法處理，用上述色譜條件分析，進行方法的精密度試驗。低、中、高濃度日內精密度分別為6、9%，2、6%，1、2%，日間精密度分別是2、3%，7、0%，0、6%，符合體內分析的相關要求[9]。