基於ITS序列的藏藥“川布”的分子鑒定研究
民族藥
作者：楊耀華 趙誌禮 嘎務 米瑪 孟千萬 倪梁紅
[摘要] 目的：對常用藏藥川布進行品種整理。方法：野外實地考察，經典分類學鑒定，植物核糖體DNA內轉錄間隔區序列測定與分析。結果：確定西藏產川布的2種基原植物為大戟科大戟屬的高山大戟Euphorbia stracheyi與大果大戟E、 wallichii；前期基礎工作表明，在甘肅藏區所使用的川布，基原植物為甘肅大戟E、 kansuensis；序列分析顯示，高山大戟E、 stracheyi與大果大戟E、 wallichii的完整序列（ITS1-5、8S-ITS2）總長度均為646 bp：其中ITS1區為261 bp，ITS2區為221 bp，5、8S編碼區為164 bp；高山大戟E、 stracheyi的ITS 1區序列在72號位具有1個雜合位點（C/G）。結論：nrDNA ITS區序列在藏藥川布及來源於大戟屬的中藥品種的鑒定中具有很好的種間分辨率，可用於川布及其相關品種的分子鑒定。
[關鍵詞] 藏藥；川布；ITS區；大戟屬
[收稿日期] 2013-04-21
[基金項目] 國家自然科學基金項目（）
[通信作者] *趙誌禮，教授，博士生導師，主要從事中藥資源與品種鑒定工作，E-mail： zhilzhao@sohu、com 川布（）為常用藏藥之一，塊根或全草入藥，具緩瀉，解毒等功效，其原植物涉及大戟科大戟屬Euphorbia多種植物[1]，來源較為複雜。
多年來，本課題組開展了藏藥的品種整理工作[2-4]。在實地考察中注意到，西藏所產的川布至少涉及該屬2種植物，而在甘肅藏區所使用的川布，基原植物為其近緣種甘肅大戟E、 kansuensis Prokh、[3]。國產大戟屬植物約80種，該屬植物均具特殊的杯狀聚傘花序（大戟花序）[5]，共性明顯，種內個體營養器官變化幅度較大，各地川布來源的多樣性及傳統鑒定方法的局限性等原因，當務之急是開展深入的品種整理與鑒定工作。
植物核糖體DNA中的內轉錄間隔區序列（nrDNA ITS區）可以提供較豐富的變異位點和信息位點，已廣泛應用於中藥的品種鑒定[6-7]。為此，在前期工作的基礎上[3]，對西藏地區所產川布品種進行實地調查與標本采集。應用形態學鑒定並結合DNA分子鑒定方法，確定其基原植物的係統學位置，測定並分析其nrDNA ITS區序列間的差異，以期為藏藥川布DNA條形碼的建立與品種鑒定提供基礎資料。
1 材料與方法
1、1 植物材料與憑證標本標本均為自采，每個居群至少采集3份標本，同時取新鮮葉片經矽膠快速幹燥，備用。憑證標本經趙誌禮教授鑒定並保存於上海中醫藥大學中藥學院藥用植物標本室（表1）。
1、2 nrDNA ITS區序列的測定葉片總DNA提取采用改進的CTAB法[8]，ITS區的擴增引物為YP1（5′-GGAAGTAGAAGTCGTAACAAGG-3′），YP4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[9]。PCR反應在20 μL的反應體係中進行，反應液中含10×Buffer 2 μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1、6 μL，上遊引物YP1（10 μmol·L-1）0、6 μL，下遊引物YP4（10 μmol·L-1）0、6 μL，dNTP Mix（10 mmol·L-1 each）0、5 μL，Taq DNA polymerase（5 U·μL-1）0、2 μL，2 μL稀釋20倍的總DNA模板，加入去離子水補齊至20 μL。反應在PCR儀（Eppendorf Mastercycler Pro S）上進行，循環參數為：95 ℃預變性4 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共33個循環，最後72 ℃延伸10 min。PCR產物經Axygen膠回收試劑盒純化， ABI 3730xl DNA測序儀測序。
1、3 序列分析為評價nrDNA ITS區在川布類藏藥及大戟屬藥用植物的分子鑒定中的意義，以大戟屬近緣植物大戟E、 pekinensis，續隨子E、 lathyris，地錦草E、 humifusa為外類群，應用分子係統學軟件MEGA 3、1進行序列分析及遺傳距離的計算（Kimura 2-parameter）。序列分析用GenBank登錄號。
2 結果與分析
2、1 分類位置的確定經標本的形態學觀察與分類學鑒定，並查閱中國科學院植物研究所植物標本表1 憑證標本與GenBank 登錄號
Table 1 Species list， voucher and GenBank accession number
物種采集地點采集時間采集號生境海拔/mGenBank 登錄號高山大戟Euphorbia stracheyi西藏拉薩2012-08-17楊耀華2012XZ001-A高山草坡4 072西藏拉薩2012-08-17楊耀華2012XZ001-B高山草坡4 072西藏拉薩2012-08-17楊耀華2012XZ001-C高山草坡4 072大果大戟E、 wallichii西藏工布江達2012-08-20楊耀華，趙誌禮2012XZ003-A路邊3 867西藏工布江達2012-08-20楊耀華，趙誌禮2012XZ003-B路邊3 867西藏工布江達2012-08-20楊耀華，趙誌禮2012XZ003-C路邊3 867甘肅大戟E、 kansuensis_____EU大戟E、 pekinensis_____AY續隨子E、 lathyris_____AF地錦草E、 humifusa_____HQ