白脈散有效成分組調控神經幹細胞增殖的實驗研究
民族藥
作者：劉慶山 陳小玉 莊述娟 李克琴
[摘要] 神經幹細胞（NSCs）具有替代及修複受損神經組織的作用，研究發現能夠通過調控NSCs內環境誘導其增殖分化，重塑神經功能，從而修複腦卒中神經病變等神經係統損傷。本實驗研究了蒙藥白脈散有效成分組（BMECG）激活NSCs增殖的藥理學作用。通過建立體內外2種損傷模型，模擬腦卒中神經病變，分別利用流式細胞術、行為學檢測、Nestin免疫組化等方法研究BMECG的腦保護作用機製。結果表明，BMECG能夠顯著提高體外培養NSCs增殖能力，有助於小鼠的行為學功能恢複，明顯改善模型小鼠大腦皮層NSCs增殖能力。因此BMECG直接針對NSCs增殖存活能力發揮作用，可能是治療腦卒中神經病變的機製之一，該藥物具有重要的研究意義和廣闊的應用前景。
[關鍵詞] 白脈散；有效成分組；神經幹細胞；腦卒中；羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯染色法
[收稿日期] 2013-04-18
[基金項目] 國家自然科學基金麵上項目（）
[通信作者] *陳小玉，E-mail：xiaoyu0767@163、com
[作者簡介] 劉慶山，Tel/Fax：（010），E-mail： nlqsh@163、com “有效成分組”是指複方中與治療目的密切相關的活性成分的總和，是傳統複方現代化的重要指導理論之一[1]。白脈散有效成分組（Baimai effective compounds group， BMECG）是課題組在“複方有效成分組”理論指導下從蒙藥經典方劑白脈散中獲得的“組分中藥”，由人參皂苷Rg1、胡黃連苷II、牛磺酸等組成，成分清楚，質量可控[2-3]。白脈散源自《四部醫典》，臨床可用於治療白脈病等病症[4]，為發揮民族藥大複方多組分、多靶點的特點，對其有效成分進行深入研究，研究BMECG對腦卒中神經病變的作用和機製，本研究采用體外實驗及整體實驗，對BMECG影響NSCs的作用進行了研究。
1 材料
1、1 動物
一日齡Wistar大鼠，SPF級，購自北京維通利華有限公司，許可證號SCXK（京）2006-0008；健康雄性昆明小鼠，SPF級，體重（20±2） g，購自北京維通利華有限公司，許可證號SCXK（京）2009-0017。
1、2 藥品
人參皂苷Rg1（純度98%，昆明雙星科技開發有限公司），胡黃連苷Ⅱ（純度90%，南京景竹生物科技公司），白脈散有效成分組為本實驗室自製，由人參皂苷Rg1、沒食子酸、胡黃連苷II、牛磺酸等成分按照質量百分比33%，30%，33%，4%組成。
1、3 試劑
胎牛血清（澳大利亞進口，浙江天航生物科技有限公司分裝）；DMEM/F12培養基、神經幹細胞培養添加劑B27 （Gibco公司）；重組牛堿性成纖維生長因子bFGF （珠海億勝生物製藥有限公司）；MAP-2兔抗鼠一抗、Nestin兔抗鼠一抗（Sigma公司）；CFDA-SE試劑盒（碧雲天生物技術研究所）；FITC標記山羊抗兔二抗（北京中衫金橋生物技術有限公司）；DAB顯色試劑盒、Mayor蘇木素（武漢博士德生物工程有限公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG （碧雲天生物技術研究所）；其餘試劑均為市售分析純。
1、4 儀器
ZB-200平衡轉棒儀（成都泰盟軟件有限公司）；超淨工作台（北京醫療設備廠）；CB150二氧化碳培養箱（德國Binder）；HERAcell 150三氣培養箱（美國Thermo公司）；流式細胞儀（FACSCalibur， BD公司，美國）；IX81自動型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；5804R型低速冷凍離心機（德國艾本德公司）。
2 方法
2、1 體外NSCs氧糖剝奪/複供增殖模型的製備
2、1、1 原代培養大鼠NSCs 取一日齡新生大鼠，以75%乙醇浸泡滅菌，置於無菌工作台中冰上操作。取出大腦皮層置於4 ℃PBS中，剝離血管和腦膜後置於小西林瓶中加2 mL培養基剪成泥狀，用吹打法分散細胞，200目鋼篩過濾。1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入 DMEM/F12完全培養基（含bFGF 50 μg·L-1，2%B27），吹打成細胞懸液。0、4%台盼藍計數，調整細胞密度，按5×105個/mL接種於25 cm2細胞培養瓶中。置於37 ℃，5%CO2培養箱中懸浮培養，待NSCs形成克隆球後適時傳代[5]。首先利用NSCs特異性表麵標記物巢蛋白（Nestin）按常規免疫熒光實驗方法進行鑒定。給藥後每天選取6個不同視野，在倒置顯微鏡下拍照，最後應用Image-Pro-Plus 6、0軟件進行處理，觀察克隆球數目變化及直徑計算其增殖能力。
培養3～4 d後，培養基中可見桑葚樣的細胞克隆聚集物，直徑多為70 μm左右，折光性強，細胞邊界清楚。培養至第5天，克隆球的數量、直徑均有明顯增加，由數百個細胞組成，形態較規則，平均直徑約為100 μm。常規培養至第7天，可見大量NSCs典型的克隆球形成，直徑增加至126 μm左右，呈球形懸浮生長。傳代3次後經免疫熒光染色顯示各克隆球內細胞呈Nestin強陽性，無神經元和神經膠質細胞NSE和GFAP的特異性熒光表現。結果顯示所培養的NSCs具有顯著的自我更新增殖能力，且表達幹細胞特性。