A、大鼠神經幹細胞常規培養第7天（×200）；B、第3代傳代克隆球（×400）；C、神經幹細胞克隆球Nestin染色（免疫熒光染色，×400）。
體外培養大鼠神經幹細胞
Fig、1 Primary cultured rat neural stem cells
NSCs誘導分化24 h後可見絕大多數NSCs貼壁生長。第7天可見細胞均勻分布於孔板中，單層生長，呈現神經元樣或膠質細胞樣形態。免疫熒光染色後顯示MAP-2陽性可見，也就表明所培養的NSCs具有分化為神經元的能力。綜上所述，本實驗體外培養大鼠NSCs顯示神經幹細胞特異性標記物，且具有自我更新能力及分化為神經元的潛能，可用於藥物實驗研究。
A、神經幹細胞克隆球貼壁誘導分化第1天（×200）；B、神經幹細胞克隆球誘導分化第3天，圖中平鋪的為神經元及膠質細胞（×100）；C、神經幹細胞克隆球誘導分化為神經元MAP-2染色，FITC標記（×100）。
體外培養神經幹細胞誘導分化
Fig、2 Primary cultured rat neural stem cells after fetal bovine serum culture
2、1、2 體外NSCs缺糖缺氧/複氧模型建立和分組大鼠NSCs以1×106個/mL接種於96孔無菌培養板中，培養第2天細胞貼壁且未發生分化時用於實驗，分為空白對照組、模型組、陽性藥組（Rg1 20 mg·L-1·d-1）、BMECG 高、中、低劑量組（50，25，12、5 mg·L-1·d-1）。除空白對照組外均進行缺氧後再複氧處理：三氣培養箱預先通入氮氣，將氧含量降至1%，培養細胞吸出原培養基，每孔加入50 μL無糖Earle′s平衡鹽溶液代替培養基，放入三氣培養箱中缺氧培養6 h，取出後換以神經幹細胞完全培養基，常規培養24 h後進行檢測。空白對照組進行常規培養，在製備模型時同步換以含2%B27和50 ng bFGF的Earle′s液。
2、1、3 CFDA-SE標記及檢測以1 μL CFDA-SE細胞標記含有1%BSA的培養液中的離散的單細胞懸液1×107個/mL，在37 ℃孵箱內孵育15 min，再用無血清培養基清洗2次，計數後調整細胞到1×106個/mL在96孔板中進行正常培養，整個過程避光操作。NSCs的增殖周期的平均時間為（22、8±1、0） h[6-7]，因此本研究選取染色後第1，3，7天作為觀測時間點。流式細胞儀用於檢測分析，取出1孔細胞（500 μL）檢測分裂峰調整密度1×105個/mL，每組上樣500 μL。單次檢測樣品為5 000個細胞，各子代增殖百分比等數據由Modfit 軟件進行分析得到。
2、2 BMECG對在體腦缺血複供小鼠模型的幹預
2、2、1 小鼠全腦缺血模型的建立及分組采用雙側頸總動脈夾閉法（bilateral carotid artery occlusion， BCAO）建立昆明小鼠全腦缺血再灌注模型[8-9]。小鼠適應性飼養3 d，自由飲食，80隻小鼠隨機分為假手術組（Sham）、模型組（Model）、陽性藥組（人參皂苷Rg1， 20 mg·kg-1·d-1）、BMECG高、中、低劑量組（100，50，25 mg·kg-1·d-1），每組12隻，剩餘8隻隨時補充試驗中死亡小鼠。10%水合氯醛（350 mg·kg-1）腹腔注射麻醉後小鼠仰位固定於動物操作台上，沿頸前正中切口，暴露雙側頸總動脈（bilateral common carotid artery， BCCA），分離伴行的迷走神經，在頸總動脈下方穿入一4號手術線，然後拉起手術線用無創微動脈夾夾閉雙側頸總動脈30 min後，鬆開動脈夾，恢複供血進行再灌，縫合切口。假手術組亦進行麻醉及分離頸總動脈操作，但不夾閉BCCA。各組小鼠造模後給藥。
2、2、2 小鼠平衡轉棒儀測試采用小鼠平衡轉棒儀觀察小鼠的運動協調能力、平衡能力以及肌肉鬆弛程度並進行模型建立成功與否的檢測[10]。本實驗選取轉棒直徑30 mm，轉速設定為0～30 s內加速至30 r·min-1，檢測時間為90 s，轉棒底部為記錄接觸板。每隻小鼠測試3次，取平均值。將大鼠放置在轉棒上，然後開啟轉棒儀，小鼠隨著轉棒的轉動在棒上爬行，當小鼠自行掉落後紅外線感應裝置自動記錄在棒時間。手術前3 d開始訓練，每天分早、中、晚訓練3次，並對在棒時間進行記錄，給藥第7，14天進行平衡轉棒儀檢測。
2、2、3 BMECG對全腦缺血複供模型小鼠病理學影響小鼠造模術後給藥第7天，每組隨機取6隻小鼠觀測組織病理變化。具體方法如下：用10%水合氯醛腹腔麻醉後經4%多聚甲醛心髒灌流斷頭取腦，石蠟包埋，製作大腦冠狀石蠟切片（厚度為4 μm），常規HE染色，光鏡下觀察組織形態學變化。