PEG修飾β—穀甾醇製備新型絞股藍總皂苷長循環脂質體的研究
製劑與炮製
作者：喻樊 楊錦明 李金娟
[摘要] 目的：探討用聚乙二醇（PEG）修飾β-穀甾醇（PEG-Sito）製備新型絞股藍總皂苷長循環脂質體的可行性。方法：以丁二酸酐為連接臂連接β-穀甾醇與PEG 2000合成PEG-Sito；以鞘磷脂和PEG-Sito為膜材采用乙醇注入法製備絞股藍總皂苷長循環脂質體；脂質體以魚精蛋白沉澱法進行包封率的測定；1H-NMR驗證PEG-Sito的合成；粒徑、電位、AFM電鏡表征該新型絞股藍總皂苷長循環脂質體。結果：1H-NMR證實了PEG-Sito的合成成功，采用乙醇注入法用PEG-Sito為材料製備長循環脂質體的包封率為74.3%，粒徑288.1 nm，電位-20.25 mV，電鏡下呈規則圓形。結論：用PEG-Sito為材料製備絞股藍總皂苷長循環脂質體方法可行，絞股藍總皂苷包封率高，形態和粒徑均較好。
[關鍵字]絞股藍總皂苷；長循環脂質體；β-穀甾醇；聚乙二醇
脂質體由於具有緩釋、增效、減毒、靶向等優點，是中藥傳遞係統中最受關注的熱點[1-2]。近年來發展的長循環脂質體或隱形脂質體（long-circulating liposomes， stealth liposomes）[3]是通過將聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺（PEG-DSPE） 鑲嵌在脂質體雙層膜之間，PEG 的長鏈在脂質體表麵形成空間位阻和親水保護層，能阻止吞噬細胞對脂質體的的識別和攝取而極大地延長脂質體的血循環時間，便於藥物進入病變組織，提高治療指數和療效[4-5]，但由於磷脂價格較高，PEG修飾後價格更加昂貴，且DSPE，PEG均為大分子，與矽膠有很強的吸附性，合成後分離純化相當困難，得率極低，大大限製了長循環脂質體在製劑領域中的應用[6]。
本課題組前期已論證了以不引發心血管疾病的植物甾醇替代膽固醇來穩定脂質體、構建脂質體的可行性[7]，又論證了采用新型磷脂——鞘磷脂製備高穩定性的脂質體的可行性[8]。在本課題中，筆者避開用PEG對磷脂修飾製備長循環脂質體的常規思路，采用PEG對價格相對低廉的小分子甾醇進行修飾，得到聚乙二醇-β-穀甾醇（PEG-Sito），然後以PEG-Sito為長循環材料和近年來被發現具有顯著的抑製腫瘤作用的絞股藍總皂苷（gypenosides）為模型藥，對用PEG-Sito製備絞股藍總皂苷長循環脂質體的可行性進行了探討，為中藥長循環脂質體的開發提供一種新的思路，具有較大的理論及應用價值。
1 材料
Model RE-52A 型旋轉蒸發儀（上海亞榮生物儀器公司）；AVYⅢ-500 MHz核磁共振儀（美國bruker公司）；360型傅立葉變換紅外光譜儀（Wartars公司）；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；HZQ-X280恒溫振蕩培養箱（太倉市華美生化儀器廠）；BS210型電子天平；WFJ2000可見分光光度計；KBS-150型數控超聲波細胞粉碎機（昆山市超聲儀器有限公司）；SCZL-A型數字智能控溫磁力攪拌器（鄭州長城科工貿有限公司）；數顯恒溫水浴鍋HH-2（國華電器有限公司）；原子力顯微鏡AFM（Veeco公司）；LGJ-10冷凍幹燥儀（北京博醫康實驗儀器有限公司）。
絞股藍總皂苷（陝西昂盛生物醫藥科技有限公司，批號20120119）；魚精蛋白（Sigma公司，批號P4672）；絞股藍皂苷對照品（阿拉丁，批號D100246）；香草醛（上海晶純實業有限公司，批號v100115）；鞘磷脂（Sigma公司，批號E1028）；β-穀甾醇（杭州大陽化工有限公司，質量分數97%）；丁二酸酐（國家集團化學試劑有限公司）；4-二甲氨基吡啶（DMAP）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、磷鉬酸均購於阿拉丁，其他試劑為分析純。
2 方法與結果
2.1 PEG-Sito的合成[9]
2.1.1 PEG-Sito的合成 路線具體合成路線。
2.1.2 β-穀甾醇衍生物的製備[10] 將β-穀甾醇（Sito）（2.50 g，6.03 mmol），丁二酸酐（3.25 g，32.48 mmol），DMAP（0.40 g，8.19 mmol）溶於50 mL二氯甲烷中，在45 ℃下劇烈攪拌回流48 h。二氯甲烷溶液用1 mol·L-1（50 mL×3）鹽酸溶液洗滌，Na2SO4幹燥在旋轉蒸發儀上旋幹，得白色固體（suc-Sito）2.80 g，收率90.3%。β-穀甾醇衍生物（suc-Sito）經薄層色譜（TLC） 鑒定，Rf=0.7（氯仿-甲醇12∶1，5%磷鉬酸顯色） ；1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：5.37（d，β-穀甾醇C6-H，1H），4.63（q，β-穀甾醇C3-H，1H），2.68（t，丁二酸CH2，2H），2.61（t，丁二酸CH2，2H）， 2.31（d，β-穀甾醇C4-H，2H）。
2.1.3 PEG-Sito的製備[11] 將suc-Sito（2.2 g，4.27 mmol），PEG 2000（12.02 g，6.01 mmol），DMAP（0.49 g， 4.01 mmol），EDC（0.85 g，4.43 mmol）溶於50 mL二氯甲烷中，常溫下攪拌48 h。二氯甲烷溶液用1 mol·L-1（100 mL×3）鹽酸溶液洗滌，Na2SO4幹燥，過濾，旋幹。粗品經矽膠（300～400目）快速柱色譜，二氯甲烷-甲醇（60∶1）洗脫，減壓濃縮收集液，得黃色固體3.06 g，收率28.7%。PEG-Sito（3）經薄層色譜（TLC）鑒定，Rf=0.4（二氯甲烷-甲醇30∶1，5%磷鉬酸、碘蒸氣顯色）；1H-NMR（500 MHz，CDCl3） δ： 5.37（d，C6-H，1H），4. 63（q，C3-H，1H），3.65（m，聚乙二醇-O-CH2 CH2-O-，約190H），2.66（m，丁二酸CH2-CH2，4H），2.31（d，β-穀甾醇C4-H，2H）。
2.2 乙醇注入法製備絞股藍總皂苷長循環脂質體
稱取絞股藍總皂苷12 mg，鞘磷脂60 mg，PEG-Sito 60 mg於100 mL燒杯中，加入乙醇20 mL使之完全溶解。取pH為7.0的磷酸鹽緩衝液20 mL，預熱到45 ℃，攪拌下用針頭勻速注入燒杯中，恒溫攪拌2 h以除去乙醇，冰浴條件下探頭超聲10 min（超聲時間2 s，間隔時間2 s，功率100 W），過0.45 μm微孔濾膜即得絞股藍總皂苷長循環脂質體[12]。
2.3 絞股藍總皂苷長循環脂質體測定方法的建立
2.3.1 對照品溶液的製備 精密稱取幹燥至恒重的絞股藍皂苷對照品50 mg加入蒸餾水定容於100 mL量瓶中作為貯備液。取貯備液適量，加水稀釋成質量濃度為0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g·L-1的對照品溶液。
2.3.2 測定波長的確定 絞股藍皂苷對照品和空白脂質體用5%香草醛冰醋酸溶液與高氯酸（2∶8）樣品顯色，在400～1 100 nm處進行光譜掃描，結果顯示對照品最大吸收波長為555 nm，且該處空白脂質體無幹擾，故選擇測定波長為555 nm。
2.3.3 線性關係考察 參照《中華人民共和國衛生部頒標準》絞股藍總苷進行。取6支具塞試管，精密量取2.2.1項下不同濃度對照品溶液1 mL，分別置15 mL具塞試管中，精密加入新鮮配製的含5%香草醛冰醋酸溶液與高氯酸（2∶8）的混合液2 mL，搖勻，密塞，置60 ℃水浴中加熱15 min，取出，立即放入冰水中冷卻2 min，精密加入冰醋酸10 mL，搖勻，以試劑作空白，照分光光度法項下（《中國藥典》2010年版一部附錄ⅤA）試驗，於（555±5） nm波長處測定吸收度。以吸光度（A）為縱坐標，質量濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程A=0.713 9C+0.074 2，r=0.999 3，線性範圍0.050 3～0.503 g·L-1。
2.3.4 精密度試驗 精密吸取同一份對照品溶液1.0 mL，置15 mL具塞試管中，按2.3.3項下自“精密加入新鮮配製的含5%香草醛冰醋酸溶液與高氯酸（2∶8）的混合液2 mL”起操作，在同一條件下連續測定吸光度5次，RSD 1.6%，表明儀器精密度良好。