狗脊不同炮製品水煎液抗維甲酸致雄性大鼠骨質疏鬆症研究
製劑與炮製
作者：徐鋼 孫娜 趙敏傑 鞠成國 賈天柱
[摘要]該研究比較了生狗脊、酒狗脊、鹽狗脊、燙狗脊和蒸狗脊的水煎液HPLC圖譜，在此基礎上，以砂燙骨碎補水煎液為陽性組，又比較了各組灌胃水煎液（質量濃度為104.2 g·L-1）4周後對維甲酸致骨質疏鬆雄性大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶s-TRAP水平和作用機製指標血清護骨素OPG，血Ca和P，IL-6，TNF-α和IL-1水平及總評分的影響。結果表明，酒狗脊和砂燙狗脊效果較好，而蒸狗脊、鹽狗脊以及生狗脊作用次之。在炮製方法的選擇方麵，加熱方式中幹熱的砂燙法優於濕熱的水蒸法，輔料中黃酒優於食鹽。該結果為闡明狗脊炮製原理和抗骨質疏鬆症作用機製提供參考。
[關鍵詞]狗脊；炮製品；水煎液；維甲酸；骨質疏鬆症；破骨細胞
中藥狗脊為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz（L.）J.Sm.的幹燥根莖，味苦、甘，性溫，歸肝、腎經，各炮製品包括生狗脊（淨製、切製）、燙狗脊、酒狗脊、蒸狗脊、鹽狗脊等均具有增強“補肝腎，強腰膝”的功效，在臨床上常用來治療骨質疏鬆症[1-3]。已有研究表明狗脊及其炮製品對去卵巢致骨質疏鬆雌性大鼠及促進成骨細胞增殖、抑製破骨細胞活性均具有一定作用[2-6]，其中，從成骨細胞角度研究較多，而其影響破骨細胞作用方麵研究甚少。本研究從維甲酸致雄性大鼠骨質疏鬆角度以整體動物為平台，以影響破骨細胞為研究目標，以檢測血清抗酒石酸酸性磷酸酶s-TRAP和計算作用機製指標總評分為評價標準，深入探討其影響破骨細胞的作用效果和機製，並對狗脊各炮製品進行比較，弄清各自的作用差別，以供生產及臨床靈活地辨別選用，同時為狗脊炮製原理的闡明和抗骨質疏鬆症作用機製提供參考。
1 材料
Waters e2695-2998高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KES-21AS20型電陶爐（深圳市康佳電器有限公司）；FA1004B型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；單道彩色移液器（Thermo公司）；Multiskan MK3酶標儀（Thermo公司）；TGL-16C型台式離心機（上海安亭科學儀器廠）；SHA-C恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）。
SD雄性大鼠，體重180～220 g，由大連醫科大學實驗動物中心提供，生產合格證號SCXK（遼）2008-0002；維甲酸（上海泛柯實業有限公司，批號R0023，純度≥98%）；生理鹽水（黑龍江科倫製藥有限公司）；大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶s-TRAP、白介素IL-6、血清中微量元素鈣（Ca）和磷（P）、血清護骨素OPG、腫瘤壞死因子TNF-α和白介素IL-1等7種血清ELISA試劑盒（上海科興貿易有限公司，批號201210）；其他試劑為色譜純或分析純。
生狗脊飲片和骨碎補飲片購自安徽省亳州市安東藥業，經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為蚌殼蕨類科植物金毛狗脊C. barometz（L.）J.Sm.的幹燥根莖以及水龍骨科植物槲蕨Drynaria fortunei（Kze.）J.Sm.的幹燥根莖；特製黃酒（即墨市古城春酒廠）；食鹽（大連市鹽業公司）；純淨水；淨河砂等。
2 方法
2.1 給藥樣品的製備
2.1.1 狗脊不同炮製品及燙骨碎補的製備[7-8] 砂燙品：參照2010年版《中國藥典》，按照優化的參數，取大小均勻、淨製過的狗脊片90 g，置8倍量河砂的鍋中加熱至滑利狀態（180～190 ℃），保持砂溫，下藥，邊炒邊埋，炒 6～7 min，出鍋篩去砂，晾涼，備用。
蒸製品：取大小均勻、淨製過的狗脊片90 g，置適宜容器內，加入清水40 mL到其中拌勻，蓋保鮮膜，密閉浸潤。之後放入蒸鍋內，武火蒸製4 h，停火後悶製4 h，取出幹燥。
酒製品：取大小均勻、淨製過的狗脊片90 g，置適宜容器內，按100∶15比例加入黃酒，並用清水稀釋至40 mL後，加入到狗脊片中拌勻，蓋保鮮膜，密閉浸潤。之後放入蒸鍋內，武火蒸製4 h，停火後悶製4 h，取出幹燥。
鹽製品：取大小均勻、淨製過的狗脊片90 g，置適宜容器內，按100∶2加入食鹽，並用清水稀釋至40 mL後，加入到狗脊片中拌勻，蓋保鮮膜，密閉浸潤。之後放入蒸鍋內，武火蒸製2 h，稍焗，取出幹燥。
燙骨碎補（陽性組）：參照2010年版《中國藥典》，按照優化的參數，取大小均勻、淨製過的骨碎補飲片90 g，置8倍量河砂的鍋中加熱至滑利狀態（180 ℃左右），保持砂溫，下藥，邊炒邊埋，燙1～2 min（毛微焦時），出鍋篩去砂，晾涼，撞去毛，篩淨備用。
2.1.2 灌胃藥液的製備 取狗脊各炮製品及燙骨碎補飲片，加10倍量水浸泡60 min後煎煮2次，每次1 h，濾過。合並濾液，濃縮濾液至質量濃度為104.2 g·L-1，即為臨床建議成人用量最大量換算為大鼠的用量[8-9]。
2.2 狗脊各炮製品灌胃藥液的HPLC分析
Agilent TC-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相甲醇-1%冰醋酸溶液（5∶95），檢測波長254 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。
2.3 動物分組、造模與指標檢測[10-11]
大鼠64隻，於室溫25 ℃，濕度30%～50%，12 h光照/黑暗循環環境下適應性飼養1周。隨機分為8組：空白組、模型組、陽性組、生品組、酒製品組、蒸製品組、砂燙品組、鹽製品組。每天上午，每組大鼠按10 mL·kg-1（ig）給藥或生理鹽水；下午，除了空白組外，其他各組大鼠用1%羧甲基纖維素鈉配成的維甲酸混懸液按70 mg·kg-1（ig）灌胃，空白組大鼠以1%羧甲基纖維素鈉（ig）灌胃，連續2周後停用維甲酸，繼續給藥2周。大鼠末次給藥後1 h，10%乙醚麻醉，腹主動脈取血，5 000 r·min-1離心10 min，取血清，-20 ℃冰箱中保存，待檢測。采用ELISA試劑盒檢測，嚴格按照試劑盒的說明進行操作。