2.4 線性關係考察 取對照品濃溶液適量,加甲醇製成如下表線性範圍的濃度,依法操作,以質量濃度(X)為橫坐標,峰麵積(Y)為縱坐標,進行線性回歸。
2.5 精密度試驗 精密吸取批號為130201的供試品溶液,按上述色譜條件重複進樣6次,記錄色譜峰麵積,計算五味子醇甲、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、五味子乙素峰麵積的RSD分別為0.83%,0.77%,0.63%,0.67%,0.57%,表明精密度良好。
2.6 穩定性試驗 精密吸取批號為130201的供試品溶液,按上述條件分別於0,4,8,12,24 h測定,記錄色譜峰麵積,計算五味子醇甲、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、五味子乙素峰麵積的RSD分別為1.5%,1.2%,0.98%,1.9%,1.3%,表明供試品溶液在24 h內穩定。
2.7 重複性試驗 精密稱取3號樣品,取6份,按照供試品溶液製備方法製備,測定,計算結果,五味子醇甲、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、五味子乙素峰麵積的RSD分別為0.98%,0.76%,0.98%,0.99%,0.70%,表明重複性良好。
2.8 回收率試驗 精密稱取批號為130201的供試品6份,每份2 g,分別精密加入對照品溶液①0.75,0.75,1.0,1.0,1.5,1.5 mL,對照品溶液②3.0,3.0,5.0,5.0,7.0,7.0 mL,另精密加入甲醇50 mL,按供試品溶液製備方法製備,上述測定條件測定,計算5種成分的回收率。
2.9 樣品測定 取5批樣品按建立的方法測定。
3 討論
本品的功效是益氣養陰、活血解毒,對於氣陰兩虛或氣陰兩虛兼心脈淤阻所致的胸悶、心悸氣短等症狀,及病毒性心肌炎具有較好的治療作用。處方中的玉竹、甘草、五味子均屬君藥,丹參和山楂為臣藥,玉竹養陰潤燥,生津止渴的作用,《中國藥典》中檢測葡萄糖的含量控製僅用於玉竹中藥材飲片,在複方製劑中未有被采用的先例,甘草具有補脾益氣、清熱解毒的作用,《中國藥典》用甘草苷的含量對其進行質量控製,但由於流動相等原因,無法在本係統中同時檢測。為了用簡便的方法檢測更多的成分,本實驗以處方中君藥五味子和臣藥丹參為檢測對象,五味子醇甲、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA、五味子乙素是五味子和丹參的主要化學成分[1],起到益氣生津、補腎養心、祛淤生新的作用。因此本實驗將以上5種成分引入本製劑的含量檢測並同時檢測,較之原標準中僅檢測丹參酮ⅡA具有更好的實用價值,對本製劑的質量控製起到了重要的作用。
通過查閱文獻[2-8]得五味子醇甲、五味子乙素的檢測波長有250 nm左右,丹參酮的檢測波長在270 nm左右,通過在220~270 nm波長處每隔5 nm進行檢測,發現丹參酮類在240 nm附近也有較大吸收。綜合各成分的吸收情況最後確定檢測波長為240 nm,結果穩定,陰性對照無幹擾。
通過查閱文獻[2-8]檢測五味子醇甲和丹參酮ⅡA流動相的組份有乙腈-水-冰醋酸、甲醇-0.1%冰醋酸,還有甲醇-水等,本實驗對各係統進行了比較,最後確定采用甲醇-水的係統,梯度洗脫,能使各成分有效分離。由於一般的色譜柱雖然能各組份分離(丹參酮ⅡA和五味子乙素較難分離),但時間較長,一般需60~70 min,本實驗試用粒徑為2.7 μm的短柱,得到了滿意的分離結果,也縮短了分析的時間。
樣品處理過程參考原標準[2]中采用超聲,但原方法處理需浸漬過夜,並反複超聲,反複提取,不僅時間長,過程複雜,結果誤差大。本方法比較過超聲、回流、索氏提取,回流因為溫度高不可取,另由於本品為大蜜丸,雖然已經盡量剪細,但索氏提取由於無法使樣品分散開來而效果不好,隻有超聲的方法能將樣品分散開來,且能減少樣品所需浸漬的時間。通過試驗,采用先超聲10 min,使其充分分散,並對浸漬時間15,30,45,60 min,後超聲時間20,30,40 min進行交叉試驗,確定浸漬30 min,後超聲30 min,使有效成分完全溶出,結果穩定,重複性好。
組分中丹參酮I在甲醇中的溶解性相較其他成分弱些,故在製備對照品溶液時將其與其他成分分開處理。丹參酮ⅡA不穩定,見光遇熱易分解,故試驗中將對照品溶於棕色量瓶中,且超聲過程中保持超聲水浴的溫度保持在40 ℃以下,得到滿意的回收率。