中藥材鎖陽的ITS2條形碼分子鑒定研究
資源與鑒定
作者：侯典雲 宋經元 石林春 楊培 陳士林 姚輝
[摘要] 目的：應用DNA條形碼技術準確、快速鑒定中藥材鎖陽及其混偽品。方法：采用試劑盒法提取藥材的基因組DNA，PCR擴增其核糖體DNA的內轉錄間隔區（internal transcribed spacer 2， ITS2）並進行雙向測序，應用CodonCode Aligner V 3.7.1對測序峰圖進行校對拚接，比較ITS2序列的GC含量，采用MEGA 5.0計算種內、種間 Kimura 2-parameter（K2P）遺傳距離，通過中藥材DNA條形碼鑒定係統比對和構建NJ 係統聚類樹進行鑒定分析。結果：鎖陽藥材的ITS2序列長度為229 bp，種內變異較小，平均K2P遺傳距離為0.003，鎖陽藥材及其混偽品的種間平均K2P遺傳距離為0.760，種間最小K2P遺傳距離明顯大於鎖陽種內的最大K2P遺傳距離。中藥材DNA條形碼鑒定係統比對和NJ樹鑒定結果均表明ITS2 序列可區分鎖陽及其混偽品。結論：ITS2條形碼可有效鑒定中藥材鎖陽及其混偽品，且具有較好的穩定性和準確性，為保障臨床安全用藥提供了新的技術手段。
[關鍵詞]鎖陽； DNA條形碼； ITS2；分子鑒定
中藥材鎖陽Cynomorii Herba為鎖陽科Cynomoriaceae植物鎖陽Cynomorium songaricum Rupr.的幹燥肉質莖。具有補腎陽，益精血，潤腸通便之功效。用於腎陽不足，精血虧虛，腸燥便秘等[1]，是藏族、蒙古族和維吾爾族等民族的特有藥材[2]。研究表明，鎖陽在防癌、抗腫瘤、提高機體免疫力、抑製人體免疫缺陷病毒（HIV）等方麵也有重要作用[3-4]。在我國，鎖陽以野生為主，主要分布在寧夏、新疆、甘肅、青海、內蒙古等西北地區[5]。近年來，由於鎖陽價格不斷攀升，藥材市場上出現地黃Rehmannine Radix、湖北地黃Rehmannia henryi N. E. Brown、裂葉地黃R. piasezkii Maxim等混偽品[6]，另外，鎖陽又常被做為肉蓯蓉Cistanches Herba的偽品使用[7]，嚴重影響了用藥安全。目前已采用性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜等技術對鎖陽及其混偽品進行了鑒別[8-9]。然而，傳統的鑒定方法需要較高的專業水平和豐富的經驗，為保障藥材質量，確保臨床用藥安全有效，亟待應用快速有效的方法對鎖陽及其混偽品進行鑒定。
DNA條形碼（DNA barcoding）技術以穩定的基因組信息為依據，有望實現對物種鑒定的標準化[10-11]。2010年，Chen等[12]首次提出把ITS2作為藥用植物鑒定的標準DNA條形碼。Yao等[13]提出ITS2序列可作為植物物種鑒定的通用條形碼。Song等對ITS2序列的鑒定機製進行了初步研究[14]。目前，ITS2序列已在多種藥用植物及藥材的鑒定中得到了應用[15-20]。本研究應用ITS2 序列對藥材鎖陽及其混偽品進行鑒定研究，為鎖陽藥材的快速準確鑒定提供保障，也為臨床用藥安全奠定基礎。
1材料
本研究所用材料共7個物種31個樣品，包括試驗樣品及GenBank下載序列。其中，鎖陽藥材樣品11個，地黃藥材樣品6個，湖北地黃樣品2個，裂葉地黃樣品2個，肉蓯蓉C. deserticola Ma樣品3個，管花肉蓯蓉C. tubulosa（Schenk）Wight 樣品4個，沙蓯蓉C. sinensis G. Beck樣品3個。所有材料經中國醫學科學院藥用植物研究所林餘霖研究員鑒定，憑證樣品保存於中國醫學科學院藥用植物研究所。實驗材料及序列的GenBank登錄號。
2方法
2.1DNA提取鎖陽藥材用75%乙醇擦拭表麵後，取約30 mg加入3%的PVP-40（聚乙烯吡咯烷酮），用DNA 提取研磨儀（Retsch MM400， Germany）研磨2 min（30次/s）後，用植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取總DNA，56 ℃水浴過夜，其餘步驟按照試劑盒說明進行。
2.2PCR擴增及測序 ITS2 序列擴增用正向引物為5′- ATGCGATACTTGGTGTGAAT -3′，反向引物為5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′[12]。PCR反應體積為25 μL，包括2×Easy Taq PCR SuperMix（TransGen Biotech Co.， China）12.5 μL，2.5 μmol·L-1引物各1 μL、模板DNA約50 ng，ddH2O補足至25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經純化後，使用ABI 3730XL（ Applied Biosystems Co.，USA）測序儀進行雙向測序。
2.3數據處理測序峰圖利用CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.， USA）校對拚接，去除低質量序列及引物區，獲得 ITS2 序列。利用軟件MEGA5.0（molecular evolutionary genetics analysis）分析比對[21]，並基於Kimura 2-parameter（K2P）模型進行種內種間遺傳距離分析，用鄰接（NJ）法構建係統聚類樹，利用bootstrap（1 000次重複）檢驗各分支的支持率。登錄中藥材DNA條形碼鑒定係統進行序列相似性搜索（BLAST） [22]。利用BLAST比對和NJ樹對鎖陽、地黃和肉蓯蓉藥材及其同屬近緣種進行鑒定分析。
3結果
3.1鎖陽藥材基因組DNA提取及PCR擴增提取的鎖陽藥材基因組DNA電泳檢測顯示條帶呈彌散狀態，說明DNA降解嚴重。NanoDrop檢測結果表明，所有鎖陽藥材基因組DNA的A260/A280均在1.6～1.8，僅有2個樣品的A260/A230小於2.0，有少量糖類物質的汙染，但所有樣品的DNA 濃度都大於10 mg·L-1。所有樣品的PCR電泳結果均顯示較亮條帶，說明無論DNA的降解或糖類及蛋白質的汙染都沒有影響鎖陽藥材ITS2序列的PCR擴增。
3.2鎖陽藥材及其混偽品的ITS2 序列分析本研究中11個鎖陽藥材的 ITS2 序列長度均為229 bp， GC 量為48.0%，序列變異較小，僅存在2個變異位點，分為3個單倍型，單倍型A1序列全部與KC相同，單倍型A2的序列全部與KC相同，KC為單倍型A3。基於K2P模型的遺傳距離分析表明，鎖陽種內變異較小，其K2P遺傳距離為0～0.009，平均K2P遺傳距離為0.003。31份樣本的種間變異較大，平均K2P遺傳距離為0.760，其中地黃與肉蓯蓉種間的K2P遺傳距離為0.032～0.353，鎖陽與地黃及肉蓯蓉的種間K2P遺傳距離為1.076～1.267。所有樣本的種間最小遺傳距離明顯大於鎖陽的種內最大遺傳距離。各樣本的ITS2 序列長度、GC量、單倍型及GenBank登錄號。
3.3鎖陽藥材及其混偽品的ITS2序列鑒定利用中藥材DNA條形碼鑒定係統對鎖陽及其混偽品的ITS2序列進行比對，結果表明ITS2 序列可以準確區分鎖陽、地黃、肉蓯蓉及其混偽品。基於ITS2 序列構建的NJ 係統聚類樹，結果顯示，鎖陽單獨聚為一支，地黃及其近緣種湖北地黃、裂葉地黃分別聚為一支，肉蓯蓉與其同屬的管花肉蓯蓉和沙蓯蓉也分別聚在一起，均表現出良好的單係性，NJ樹可明確區分鎖陽及其混偽品。因此，ITS2序列作為條形碼可快速準確鑒別鎖陽及其混偽品。4討論