淫羊藿總黃酮的生物轉化過程分析
製劑與炮製
作者：高霞 劉璿 陳彥 王瑩 賈曉斌
[摘要] 該文旨在研究淫羊藿總黃酮在體外水解酶作用下的生物轉化過程。主要采用蝸牛酶水解淫羊藿總黃酮，用HPLC測定總黃酮中主要黃酮的轉化。數據結果顯示已知主要黃酮成分淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C都在1～2 h內分別完全轉化為寶藿苷Ⅰ，箭藿苷A，箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，隨著水解時間的延長，各轉化產物被繼續水解。因此可得出結論，蝸牛酶在37 ℃，pH 6.0的Hank′s平衡鹽溶液中，2 h內能將淫羊藿主要總黃酮轉化為次級苷或苷元，且其酶解產物與腸道代謝產物相一致。
[關鍵詞]淫羊藿總黃酮；蝸牛酶；生物轉化
淫羊藿是傳統的補腎中藥，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的作用[1]。淫羊藿中黃酮成分是主要活性成分，其中8-異戊烯基取代黃酮苷是主要代表活性黃酮，主要有淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C和寶藿苷等[2]。淫羊藿黃酮苷在腸道的吸收較差[3]，水解是淫羊藿黃酮苷生物轉化的起始步驟，去糖基化使得糖苷易於在腸道擴散和吸收。因此口服淫羊藿黃酮，主要以腸道代謝產物（次級苷或苷元）的形式被吸收而發揮療效[4-5]，且據文獻報道腸道代謝產物寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元的抗骨質疏鬆等的生物活性更強[6-7]。但由於人體腸道存在的水解酶（腸道黏膜酶和腸道菌酶）會因人種、年齡、疾病而有所差異[8-9]，因此會影響淫羊藿黃酮苷的水解進而影響其吸收和療效的發揮。在體外選擇高效安全的淫羊藿黃酮苷水解酶，將其加入淫羊藿總黃酮中口服，可以增強淫羊藿總黃酮腸道水解功能，是促進淫羊藿總黃酮口服吸收，增加其生物利用度，提高藥效的有效途徑之一。
蝸牛酶是從蝸牛的嗉囊和消化道中提取的一種混合酶，目前已明確其含有纖維素酶、果膠酶、澱粉酶、蛋白酶等20多種酶，具有很強的生物轉化能力[10]。課題組前期研究表明蝸牛酶可以水解淫羊藿苷[11]，且其代謝產物與腸道代謝產物一致，因此本研究采用蝸牛酶水解淫羊藿總黃酮，研究主要已知黃酮和未知黃酮的生物轉化情況，為構建新型的淫羊藿總黃酮仿生酶解給藥係統提供前期的研究基礎。
1材料
Agilent 1200型高效液相色譜儀（DAD檢測器，四元泵，美國Agilent公司）；數顯氣浴恒溫振蕩器（金壇市雙捷實驗儀器廠）；METTLER AL204 1/10萬天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）。
蝸牛酶（上海源葉生物科技有限公司）；淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C和寶藿苷Ⅰ對照品（上海源葉生物科技有限公司，純度>98%）；淫羊藿苷元對照品（自製，純度﹥98%）；乙腈為色譜純，水為高純水，其餘試劑均為分析純。
淫羊藿購自吉林敦化，經南京中醫藥大學吳德康教授鑒定為朝鮮淫羊藿。
2方法與結果
2.1HPLC測定淫羊藿主要黃酮的分析方法建立
2.1.1色譜條件 Zorbax SB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流動相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫，0～15 min，10%～25%A，15～38 min，25%A，38～61 min，25%～71%A，61～75 min，71%～100%A；流速1.0 mL·min-1；檢測波長270 nm；柱溫30 ℃。
2.1.2對照品溶液的製備精密稱取淫羊藿苷5.33 mg，朝藿定A 8.42 mg，朝藿定B 9.05 mg，朝藿定C 8.26 mg，寶藿苷Ⅰ5.26 mg，淫羊藿苷元8.19 mg，加無水乙醇溶解稀釋至10 mL，作為儲備液。
2.1.3供試品溶液的製備取轉化後的混懸液適量，加無水乙醇終止酶解反應，搖勻，離心後即得。
2.1.4標準曲線的繪製精密量取淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，寶藿苷Ⅰ和淫羊藿苷元儲備液適量，加無水乙醇稀釋成一定濃度的對照品溶液。所含淫羊藿苷的質量濃度分別為1.7，3.3，6.7，13.3，26.6，53.3，106.6 mg·L-1，所含朝藿定A的質量濃度分別為2.6，5.3，10.5，21.0，42.1，84.2，168.4 mg·L-1，所含朝藿定B的質量濃度分別為1.4，2.8，5.7，11.3，22.6，45.2，90.5，181.0 mg·L-1，所含朝藿定C的質量濃度分別為2.6，5.2，10.3，20.6，41.2，82.6，165.2 mg·L-1，所含寶藿苷Ⅰ的質量濃度分別為3.3，6.6，13.2，26.3，52.6，105.2 mg·L-1，所含淫羊藿苷元的質量濃度分別為5.1，10.2，20.5，41.0，81.9，163.8 mg·L-1。分別精密吸取各對照溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰麵積。以檢測質量濃度（x，mg·L-1）為橫坐標，峰麵積（y）為縱坐標，進行線性回歸，得6種成分的回歸方程、相關係數及線性範圍。淫羊藿苷的線性回歸方程為y=30.459x+24.061，r=0.999；朝藿定A的線性回歸方程為y=17.443x+23.584，r=0.999；朝藿定B的線性回歸方程為y=27.196x+21.610，r= 0.999；朝藿定C的線性回歸方程為y=18.415x+19.589，r= 1.000；寶藿苷Ⅰ的線性回歸方程為y=24.718x+23.400，r=0.999；淫羊藿苷元的線性回歸方程為y=22.638x+80.731，r=0.999。結果表明，淫羊藿苷在0.017～1.066 μg，朝藿定A在0.026～1.684 μg，朝藿定B在0.014～1.810 μg，朝藿定C在0.026～1.652 μg，寶藿苷Ⅰ在0.033～1.052 μg，淫羊藿苷元在0.051 2～1.638 μg 都呈良好的線性關係。
2.1.5精密度試驗精密吸取上述各對照品溶液，進樣10 μL，重複6次，計算峰麵積的RSD，結果淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，寶藿苷Ⅰ，淫羊藿苷元的日內精密度分別為0.50%，0.38%，0.45%，0.85%，1.1%，0.48%；日間精密度分別為0.71%，0.98%，1.0%，1.9%，2.1%，0.83%，表明儀器的精密度良好。
2.1.6穩定性試驗取上述供試品溶液，分別於0，1，2，4，8，12，24 h進樣測定，每次10 μL，結果淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，寶藿苷Ⅰ，淫羊藿苷元淫羊藿苷峰麵積的RSD分別為0.68%，1.6%，1.6%，2.2%， 2.4%，1.8%，表明樣品溶液在24 h內穩定。