2.1.7重複性試驗精密稱定同一批樣品，按供試品溶液製備方法分別製備5份供試品溶液，測定6種成分的含量，結果淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，寶藿苷Ⅰ，淫羊藿苷元淫羊藿苷含量的RSD分別為0.70%，1.6%，1.9%， 2.2%， 2.0%， 2.0%，表明樣品的重複性較好。
2.1.8加樣回收率試驗精密量取已知含量的同一批淫羊藿黃酮酶解液各 6 份，加入一定量的對照品，按樣品處理方法製備並進樣10 μL，計算各對照品的平均加樣回收率和RSD。結果淫羊藿苷、朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，寶藿苷Ⅰ，淫羊藿苷元的平均回收率分別為100.2%，99.04%，100.5%，100.6%，98.63%，99.15%；RSD分別為2.0%，2.2%，1.8%，2.5%，2.3%，1.4%。
2.2淫羊藿總黃酮的製備
稱取淫羊藿300 g，加15倍量50%乙醇回流提取2次，每次2 h，合並2次濾液，回收乙醇，濃縮至1 000 mL，即得含生藥0.3 g·mL-1的總黃酮提取物，提取物的HPLC。
2.3淫羊藿總黃酮的生物轉化
取含生藥0.3 g·mL-1的淫羊藿提取物400 μL，加入pH 6.0的Hank′s平衡鹽溶液10 mL中，放入37 ℃恒溫振蕩器中保溫。另精密稱取蝸牛酶10 mg，用pH 6.0的Hank′s平衡鹽溶液10 mL溶解。將酶液加至等量的淫羊藿提取物溶液中，在37 ℃恒溫振蕩器中反應，分別在0，0.5，1，1.5，2，3，4，5，6 h時取反應液150 μL，立即加乙醇300 μL終止反應，渦旋，離心後進HPLC分析測定，進樣量20 μL，試驗平行3次，淫羊藿總黃酮酶解液。
淫羊藿提取物中含有的主要二糖苷淫羊藿苷與三糖苷朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C含量隨酶解時間的變化。2 h時，在酶解液中已檢測不到淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，說明在2 h內，上述黃酮苷已被完全水解。前期采用HPLC-MS/MS研究證明淫羊藿苷、朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C水解掉C7位上的葡萄糖所生成的次級苷，即為寶藿苷Ⅰ，箭藿苷A，箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，保留時間分別為53.998，50.561，51.520，51.905 min，本實驗對酶解液進行檢測，發現有大量的寶藿苷Ⅰ，箭藿苷A，箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的生成，因此推測在2 h內，淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C經蝸牛酶酶解轉化為寶藿苷Ⅰ，箭藿苷A，箭藿苷B和鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ。
經鑒定保留時間為50.655，51.830，52.229 min的色譜峰分別是箭藿苷A，箭藿苷B，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，由於箭藿苷A，箭藿苷B，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ單體較難獲得，因此以其峰麵積的變化來考察，箭藿苷A，箭藿苷B，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的峰麵積隨酶解時間的變化。在總黃酮提取物中含有箭藿苷A，箭藿苷B，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，但較之淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C含量較低，隨著酶解開始，這3種黃酮的含量開始增加，到 1 h左右達到最大，約增大為原來的5～6 倍，隨後箭藿苷A繼續被水解，於4 h 時轉化了31.86%，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ轉化了18.87%，而箭藿苷B基本不再水解。
本實驗考察了提取物中寶藿苷Ⅰ，淫羊藿苷元含量隨時間的變化。寶藿苷Ⅰ在 1 h內隨著酶解時間的延長含量不斷增大，到 1 h達到最大，約為酶解之初的2倍，之後隨著酶解時間的延長含量逐漸下降，於5 h寶藿苷Ⅰ轉化了91.50%，5 h後趨於飽和，但是比酶解前含量低了近5倍，該結果說明在酶解最初的1 h，一方麵淫羊藿苷水解為寶藿苷Ⅰ，另一方麵寶藿苷Ⅰ也會被水解為苷元，但淫羊藿苷的水解速率大於寶藿苷Ⅰ，因此觀察到寶藿苷Ⅰ的含量呈上升趨勢，1 h後寶藿苷Ⅰ的水解速率大於淫羊藿苷的水解速率，且淫羊藿苷在2 h已近轉化完全，而寶藿苷Ⅰ又不斷水解為苷元，因此含量不斷下降，至5 h轉化趨於穩定。這一結果也可從淫羊藿苷元含量變化來反映。作者未在藥材提取物中檢測到苷元的存在，但是隨著酶解時間的延長，苷元在4 h內呈線性增長，4 h後增長趨於平緩。這也說明除寶藿苷Ⅰ外，可能還有其他次級苷水解生成淫羊藿苷元。
此外通過二極管陣列檢測器對色譜峰的紫外吸收圖譜進行比對，發現保留時間為 15.013，18.504，19.005，22.010，24.163，33.015，43.716，45.237，47.09，48.11 min的1～10號峰的光譜圖與淫羊藿苷相似，推測為黃酮成分，其峰麵積也有較大變化。1號峰3 h水解了86.15%之後趨於飽和，2號峰和3號峰在3 h內水解完全，4～8號峰在1 h水解完全。9號峰和10號峰在未酶解提取物中含量較少，但在酶解過程中不斷增加，在2～3 h左右增長趨於飽和，說明有黃酮成分酶解轉化生成了9號峰和10號峰。
3討論
本研究對體外酶解淫羊藿總黃酮的過程進行了分析，為模擬體內腸道情況，選擇了蝸牛酶，這是由於蝸牛酶是動物性酶，在人體腸道環境下活性較高，且課題組前期的研究證明蝸牛酶生物轉化淫羊藿苷的過程與腸道酶及腸道菌的轉化過程相似。為模擬體內腸道環境，酶解溫度選擇了37 ℃，緩衝液選擇了pH 6.0的Hank′s平衡鹽溶液，目的在於今後有可能將酶加入淫羊藿總黃酮中口服，增強淫羊藿總黃酮腸道水解功能，提高淫羊藿總黃酮的生物利用度，為構建新型的淫羊藿總黃酮仿生酶解給藥係統。
由於食物與藥物在人體腸道停留的時間約為3～6 h[12]，而本試驗在現有條件下，主要黃酮苷在約2 h已水解完全，因此對蝸牛酶的濃度、酶的活力，底物與酶的比例還需進一步考察。從本試驗結果看，淫羊藿總黃酮中的主要黃酮苷如淫羊藿苷，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C和寶藿苷的酶解產物與體內腸道的代謝產物基本一致[13-14]，但由於總黃酮中還有許多未知黃酮，這些未知黃酮及其酶解產物的結構需進一步進行解析並與體內腸道代謝情況的進行對比，此外淫羊藿總黃酮酶解產物箭藿苷A，箭藿苷B，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ和其他未知產物的藥效是否比原型藥有所提高，還需進一步考察。
[參考文獻]
[1] 王霄暘，謝人明，孫文基. 淫羊藿屬藥用植物黃酮類化合物的研究進展[J]. 中藥藥理與臨床， 2010， 26（5）： 171.
[2] 於霄，宋靜，熊誌立，等. 一測多評法測定淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷的含量[J]. 中國中藥雜誌， 2010， 35（24）： 3310.
[3] 陳彥，賈曉斌， Hu Ming，等. Caco-2細胞單層研究淫羊藿黃酮類成分的吸收轉運[J]. 中草藥， 2009， 40（2）： 220.